ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ

Сила воли ведет к действию, а позитивные действия формируют позитивное отношение

Как определить диапазон голоса - ваш вокал

Игровые автоматы с быстрым выводом

Как цель узнает о ваших желаниях прежде, чем вы начнете действовать. Как компании прогнозируют привычки и манипулируют ими

Целительная привычка

Как самому избавиться от обидчивости

Противоречивые взгляды на качества, присущие мужчинам

Тренинг уверенности в себе

Вкуснейший "Салат из свеклы с чесноком"

Натюрморт и его изобразительные возможности

Применение, как принимать мумие? Мумие для волос, лица, при переломах, при кровотечении и т.д.

Как научиться брать на себя ответственность

Зачем нужны границы в отношениях с детьми?

Световозвращающие элементы на детской одежде

Как победить свой возраст? Восемь уникальных способов, которые помогут достичь долголетия

Как слышать голос Бога

Классификация ожирения по ИМТ (ВОЗ)

Глава 3. Завет мужчины с женщиной

Оси и плоскости тела человека - Тело человека состоит из определенных топографических частей и участков, в которых расположены органы, мышцы, сосуды, нервы и т.д.

Отёска стен и прирубка косяков - Когда на доме не достаёт окон и дверей, красивое высокое крыльцо ещё только в воображении, приходится подниматься с улицы в дом по трапу.

Дифференциальные уравнения второго порядка (модель рынка с прогнозируемыми ценами) - В простых моделях рынка спрос и предложение обычно полагают зависящими только от текущей цены на товар.

История открытия ферментов

Федеральное государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

"Мурманский государственный технический университет"

Кафедра биохимии

С.И. Овчинникова

ОСНОВЫ ЭНЗИМОЛОГИИ
РАЗДЕЛ 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ

1.1. Определение ферментов, отличие и сходство ферментов и неорганических катализаторов

Ферменты, (от лат. fermentum – закваска), или энзимы (от греч еп – внутри, гуте –закваска) – биологические катализаторы белко­вой природы, синтезируемые живой клеткой и активирующие биохи­мические процессы.

Русский физиолог И.П. Павлов называл ферменты "возбудите­лями жизни".

В настоящее время известно около 3000 ферментов, более 200 из них получено в кристаллическом состоянии.

Ферментология (энзимология) – наука о ферментах и катали­зируемых ими реакциях.

Каждый вид ферментов катализирует превращение определен­ных веществ (субстратов), иногда — лишь единственного вещества в единственном направлении.

Субстрат – соединение, превращение которого катализирует фермент, образуя с ним фермент-субстратный комплекс.

Необходимо различать ферменты и неорганические катализаторы.

Таблица 1. Различие ферментов и неорганических катализаторов

Сходство между ферментами и катализаторами небиологиче­ской природы заключается в том, что они:

1. Не меняют направления реакции.

2. Катализируют энергетически реальные реакции.

3. Не смещают равновесия обратимых процессов.

4. Не расходуются в процессе реакции.

Химическая природа ферментов

Ферменты – это глобулярные белки. Они подразделяются на одно­компонентные (простые белки) и двухкомпонентные (сложные белки) фер­менты. Сложные ферменты называются холоферментами. Белковые ком­поненты двухкомпонентных ферментов называются апоферментами, небелковые – кофакторами. Последние подразделяются на коферменты и простетические группы. Кофермент – это небелковая часть, лабильно связанная с апоферментом, простетическая группа – небел­ковая часть, прочно связанная с белком.

История открытия ферментов

Эликсиры (от араб. аль-иксир – камень мудрости или жизнен­ный сок) были для алхимиков средневековья теми магическими на­питками, которые облагораживают "неблагородные" вещества, про­длевают жизнь, способны излечить любую болезнь.

Эликсиры – ферменты (энзимы) – это биологические катализа­торы, без которых не было бы жизни. Они катализируют, управляют и регулируют миллионы химических превращений во всех живых су­ществах. Лишь во взаимодействии с ферментами становятся актив­ными витамины, гормоны и микроэлементы. Многие лечебные сред­ства, такие как сульфамиды и антибиотики, а также ядовитые вещества (например, свинец, ртуть, яды грибов, пестициды и газы нервно-паралитического действия) оказывают свое действие путем торможе­ния функционирования ферментов.

Ферменты помогают врачам ставить точные диагнозы. Они ус­пешно используются при лечении нарушений пищеварения, тромбо­зов, для заживления ран. В пищевой промышленности ферменты используют в пивоварении, производстве сыра, при тендеризации мяса и осветлении фруктовых соков. Дубление кож также "работа" ферментов. В быту ферменты добавляют в моющие средства. С по­мощью ферментов сегодня производятся миллионы тонн низкокало­рийного "сахара", обладающего более сладким вкусом, чем обычный сахар, синтезируются новые виды медикаментов, производятся про­дукты для диетического питания, а также корма. Успехи генной ин­женерии стали возможны лишь благодаря использованию ферментов в качестве молекулярных инструментов.

Уже в Древнем Египте люди наблюдали и использовали на прак­тике ферментативные реакции, например брожение при варке пива и выпечке хлеба.

Пять-шесть тысяч лет тому назад шумеры в Вавилоне также варили пиво. В пивоварнях из муки грубого помола делали караваи, которые слегка запекали, зачем крошили и оставляли для сбраживания. Пивоварение было важным государственным делом. Царь Вави­лонии Хаммурапи (1792–1750 гг. до н. э.) в известном своде законов (памятник древневосточного права) постановил, что пивоваров-изготовителей некачественного пива ждет суровая кара: если их уличат в разбавлении пива водой, они будут утоплены в бочках с этим пивом или их заставят пить его до тех пор, пока не наступит смерть.

Гомер описал свертывание молока в присутствии млечного сока фигового дерева.

Издавна для приготовления сыра использовали сычужный фер­мент, получаемый из слизистой желудка телят. Великий философ и ученый Аристотель (384–322 гг. до н. э.), сочинения которого охваты­вают все отрасли современного ему знания, в труде "О возникновении животных" упоминал о сычужном ферменте как о виде молока, обра­зующегося в желудке молодых животных в период их молочного вскар­мливания. По его мнению, это молоко, содержащее "огонь", который образуется за счет тепла тела животного при свертывании молока. Если заменить слово "огонь" словом "фермент", то это описание Аристотеля будет звучать вполне современно.

Изучение ферментов началось лишь в конце XVIII века. Обыч­но "ферментацией" (от лат. fervere – варить) назывались процессы разложения одного вещества под действием другого; при этом про­цессы, происходящие с образованием пузырьков углекислого газа, назывались брожением.

К первым научным описаниям ферментативных процессов от­носится описание пищеварения у животных. Рене Антуан Реомюр (1683–1757) при постановке своих экспериментов исходил из предположения о том, что хищные птицы отрыгивают непереваренные ос­татки пищи. Реомюр сконструировал маленькую проволочную кап­сулу, в которую был положен кусок мяса. Капсулу с мясом поместил в клетку к сарычу. Через 24 часа сарыч выплюнул эту капсулу. В ней остался размягченный кусок пищи, который, однако, не пор­тился. "Этот процесс может быть только результатом действия како­го-то растворителя", – к такому заключению пришел Реомюр.

Ладзаро Спалланцани (1729–1799), профессор истории естествоз­нания университета города Падуя, сообщал о подобных эксперимен­тах. Однако он не рассматривал пищеварение как процесс фермента­ции по той простой причине, что при этом не образовывались пу­зырьки газа.

Более подробно процесс ферментации был изучен одним из ос­новоположников современной химии Антуаном Лораном Лавуазье (1743–1794). Изучая спиртовое брожение, происходящее при изго­товлении вина, он обнаружил, что глюкоза превращается в спирт и углекислый газ.

К началу XIX века в науке преобладала единая точка зрения: ферментация – это химические изменения, вызываемые некоторыми специфическими формами органического материала, а именно "фер­ментами". В 1814 г. русский ученый (немец по происхождению), ака­демик Петербургской Академии наук Константин Готлиб Сигизмунд Кирхгоф (1764–1833) показал, что образование сахара из глюкозы в проросших зерновках злаков обусловлено химическим процессом, а не появлением ростков. Несколько лет спустя американский воен­ный врач Уильям Бомонт (1785–1853) подтвердил эксперименты Ре­омюра и Спалланцани. При лечении пациента с огнестрельным ране­нием в живот на незаживающей сквозной ране в области желудка ему удалось проанализировать процесс пищеварения различных пи­тательных веществ. Было установлено, что под действием желудочно­го сока пища может перевариваться и вне живого тела. Бомонт высказал предположение, что наряду с соляной кислотой в желудоч­ном соке содержатся еще и "другие активные химические начала".

В 1833 г. Ансель Пайен (1795–1871), директор сахарного завода в Париже, вместе со своим коллегой Жаном Франца Персо (1805–1865) выделили из проросших зерен ячменя "вещество, разжижающее крах­мал". При этом они уже тогда обнаружили у этого вещества свой­ства, которые по современным представлениям относятся к опреде­ляющим универсальным свойствам ферментов. Например, относительно небольшие количества препарата могли разжижать большие количе­ства крахмала, однако при нагревании препарат утрачивал эту спо­собность. Активная субстанция могла быть получена в порошкооб­разном виде из раствора, а после повторного растворения в воде вновь становилась активной. Описанная субстанция, получив­шая название диастазы (речь идет об амилазе) (от греч. dia – через и stasis – стояние, разделение), была первым растительным ферментом, изученным в очищенном виде в лаборатории.

Три года спустя одному из основоположников клеточной теории, немецкому биологу Теодору Шванну (1810–1882) удалось получить в чистом виде и изучить фермент желудочного сока животного про­исхождения – пепсин. Таким образом, он обнаружил одно из тех "других химических начал", о которых писал Бомонт.

Значительно опередил научную мысль своего времени шведский химик Йене Якоб Берцелиус (1779–1848), который утверждал, что ферментативные процессы представляют собой каталитические про­цессы. Он определил катализаторы как тела, присутствие которых вызывает химические процессы и без которых эти процессы происхо­дить не могут. Сами они в ходе химических реакций остаются в неиз­менном виде. В 1836 г. Берцелиус писал: "У нас есть основания пола­гать, что в живых растениях и у животных протекают тысячи каталитических процессов между тканями и жидкостями".

Однако последующие открытия поставили под сомнение такое определение фермента. В 1837 г. Т. Шванн обнаружил, что гниение, т. е. разложение веществ, по определению относящееся к процессам ферментации, вызывают микроорганизмы. Складывалось впечатле­ние, что под термином "ферменты" понимают совершенно разные понятия: с одной стороны, невидимые, "обладающие формой", "орга­низованные" активные начала, такие как возбудители гниения, а с другой – видимые в растворе, "не имеющие формы", "неорганизо­ванные начала"(пепсин и диастаза).

Начались дискуссии о природе ферментов. В 1680 г. нидерланд­ский натуралист Антони ван Левенгук (1632–1723) с помощью мик­роскопа собственной конструкции обнаружил, что дрожжи представ­ляют собой круглые живые "частицы", однако вплоть до начала XIX века дрожжи считали особым химическим соединением, фермен­том. Примерно через 150 лет после Левенгука Шванн показал, что дрожжи действительно живые микроорганизмы, а спиртовое броже­ние – результат их жизнедеятельности. Это утверждение было, одна­ко, единодушно отвергнуто выдающимися химиками того времени, такими как Йене Якоб Берцелиус, Юстус Либих и Фридрих Велер.

Представление о том, что спиртовое брожение вызывается жиз­недеятельностью некоего микроорганизма, получило распространение лишь после опубликования в 1857 г. работ Луи Пастера (1822–1895), благодаря которым спиртовое брожение стали связывать с жизнедея­тельностью дрожжей, причем было признано, что этот процесс всегда сопровождается их ростом и размножением. Оппонируя Пастеру, Ли­бих приводил в качестве примера действие диастазы и пепсина – "неживых субстанций", вызывающих изменения, подобные тем, которые происходят в присутствии ферментов. Он обвинял Пастера в том, что тот привлекает некую воображаемую "жизненную силу" объяснения более или менее простых химических процессов. Тем не менее в научных спорах благодаря практическим успехам микро­биологии на определенное время победил принцип, выдвинутый Пастером – "нет ферментации без жизни".

В результате сложилась своеобразная ситуация. Считалось, что существует два класса ферментов: организованные (истинные) фер­менты, такие как дрожжи и другие микроорганизмы, и неорганизо­ванные (растворимые) ферменты, такие как диастаза и пепсин. Со­гласно этим представлениям неорганизованные ферменты не связаны с процессами жизнедеятельности. Поэтому в 1876 г. на заседании Общества истории естествознания и медицины Вильгельм Фридрих Кюне (1837–1900) предложил "во избежание недоразумений и обременительных описаний... называть ферменты, не имеющие фор­мы, или неорганизованные ферменты, которые могут действовать в организме и вне его, "энзимами".

Организованные ферменты были "последним бастионом" вита­лизма², приверженцы которого проповедовали наличие в организ­мах сверхъестественной vis vitalis (жизненной силы). Господствовала точка зрения: органические соединения принципиально невозможно получить в лабораторных условиях, поскольку они обладают жизнен­ной силой. Это представление было опровергнуто в 1828 г., когда Фридриху Велеру удалось синтезировать мочевину.

В 1897 г. немецкий профессор Эдуард Бухнер (1860–1917) на­нес витализму "смертельный" удар. Он пришел к выводу, что выде­лить находящийся в дрожжах "энзим брожения" можно чисто меха­ническим путем, разрушая дрожжевые клетки. Первые опыты по выделению фермента путем многократного замораживания и оттаи­вания клеток или путем растирания дрожжей в ступке были неудач­ными. По предложению своего ассистента Бухнер усовершенствовал методику: в ступку с дрожжами он добавил кварцевый песок и ки­зельгур, тщательно растер большим пестиком, полученную массу завернул в плотную парусину и отжал на гидравлическом прессе. При этом был получен бесклеточный дрожжевой экстракт, который легко разлагался, поэтому для хранения Бухнер на ночь растворил его в концентрированном растворе сахара. В прозрачном растворе началось активное образование углекислого газа.

Бухнеру удалось впервые наблюдать спиртовое брожение в от­сутствии живых дрожжевых клеток в бесклеточной жидкости. Это был момент рождения современной биохимии. Месяц спустя, проведя по­вторные опыты, которые привели к тем же результатам, он выступил перед общественностью со своим сенсационным сообщением. Бухнер назвал открытый им фермент зимазой это был первый фермент, вы­зывающий образование газа. За это открытие, ознаменовавшее собой начало новой эры в развитии науки, Бухнеру в 1907 г. была присужде­на Нобелевская премия в области химии. В 1897 г. он доказал, что ферментация возможна и в отсутствии живых клеток. Это открытие положило конец искусственному делению ферментов на организован­ные субстанции и энзимы. Организованными субстанциями оказались клетки дрожжей или других микроорганизмов. Их активность объяс­нялась тем, что они были "начинены" ферментами.

Немецкий химик Мориц Траубе (1826–1894) уже в 1858 г. выс­казал предположение о том, что ферменты, вопрос о химической классификации которых еще не был решен, представляют собой бел­ки (протеины). Однако подобные взгляды не встретили поддержки других ученых, поскольку не подкреплялись никакими доказатель­ствами. Впоследствии было обнаружено, что подобно белкам фер­менты состоят из углерода, водорода и азота, при нагревании они свертываются, под действием большинства осадителей белка выпада­ют в осадок и дают химические реакции, характерные для белков. Результаты этих экспериментов были встречены в научных кругах с большим скептицизмом.

В 1918 г. Рихард Мартин Вильштеттер (1872–1942), лауреат Но­белевской премии, ученик Адольфа Байера и один из корифеев орга­нической химии своего времени, вместе со студентами начал системати­ческую работу по выделению и очистке ферментов. Хотя при этом удалось получить очищенные ферменты, обладающие высокой актив­ностью, однако белки в этих препаратах не были обнаружены. Поэто­му Вильштеттер сделал получивший признание в научных кругах вы­вод о том, что ферменты – это неизвестные органические соединения небелковой природы, а белки служат носителями этих соединений.

Американский биохимик Джеймс Бетчеллер Самнер в 1926 г. также проводил работы по выделению фермента в чистом виде. В качестве исходного материала он использовал бобы Сanavalia ensiformis, богатые ферментом уреазой. Уреаза катализирует разложение мочевины на углекислый газ и аммиак. Сначала Самнер из­мельчил бобы на кофейной мельнице и из полученной муки экстрагировал уреазу с помощью растворителя. После фильтрования экстракт был оставлен на ночь в холодном месте. На следующее утро, к великому удивлению исследователя, в фильтрате были обнаружены маленькие восьмигранные кристаллы. После перекристаллизации они разлагали мочевину в 700 раз активнее, чем исходная мука.

Несмотря на скептическое отношение Вильштеттера к полученным Самнером результатам, по истечении некоторого времени научный мир поверил в силу кристаллов ферментов. Выделение фермента в виде кристаллов доказывало специфичность данного вещества. Кроме того, кристаллы уреазы проявляли типичные свойства белков. Полученные Самнером результаты были подтверждены американским биохимиком Джоном Хоуардом Нортролпом, который в 30-х годах получил в виде кристаллов пищеварительные ферменты пепсин, трипсин, химотрипсин и их неактивные предшественники. Лишь много позже стало понятно, почему в ферментных препаратах Вильштеттера не удавалось обнару­жить присутствие белков: несмотря на тщательную очистку, они были настолько сильно разбавлены, что с помощью имевшихся в то время малочувствительных методов в них просто нельзя было обнаружить белок. В 1946 г. за совместную работу Самнеру и Нортролпу была присуждена Нобелевская премия в области медицины. Через 20 лет после получения первого кристаллического фермента стало очевидно, что ферменты представляют собой белки.

Таким образом, ферменты, безусловно, обладают всеми свой­ствами белков. Они активны и стабильны лишь в определенных усло­виях. В физиологическом диапазоне скорость большинства фермен­тативных реакций, как и всех других химических реакций, с повышением температуры возрастает. Однако при более высоких температурах начинается разрушение структуры белка, происходит денатурация и, как следствие, инактивация фермента. Ферменты функ­ционируют при нормальном давлении и, как правило, лучше всего в нейтральной среде. Однако существуют также ферменты (напри­мер, пепсин, который функционирует в желудке), для действия кото­рых оптимальной является кислая среда. Некоторые ферменты луч­ше всего функционируют в щелочной среде.

Но и в оптимальных условиях наблюдается "старение" фермен­тов: при потере активности они часто расщепляются специфическими для данной клетки протеазами, после чего необходим синтез новых молекул тех же ферментов.

РАЗДЕЛ 2. КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

2.1. Номенклатуры

Тривиальная номенклатура. Первоначально ферментам давали названия, образуемые путем добавления окончания -аза к названию субстрата, на который данный фермент действует, например:

Амилазы (от греч. amilos – крахмал) – ферменты, гидролизующие крахмал (амилон).

Липазы (от греч. lipos – жир) – ферменты, гидролизующие жиры.

Протеиназы (от греч. protos – главный, важный) – ферменты, гидролизующие белки (протеины).

Номенклатура по типу реакции. Ферментам, катализирующим близкие по типу реакции, давали названия, указывающие тип реак­ции: ацилазы, декарбоксилазы, дегидрогеназы, оксидазы.

Номенклатура, введенная Международным биохимическим со­юзом – International Union of Biochemistry (IUB). Основные принци­пы этой номенклатуры состоят в следующем:

- ферменты называются и классифицируются в соответствии с типом и механизмом;

- реакции и ферменты, которые их катализируют, подразделя­ются на шесть классов, в каждом из которых имеется несколько подклассов (от 4 до 18);

- название фермента состоит из двух частей (первая часть -название субстрата или субстратов, вторая – тип катализируемой реакции) и оканчивается на -аза;

- дополнительная информация заключается в скобки;

- каждый фермент имеет кодовый номер по классификации ферментов (КФ). Первая цифра характеризует класс реакции, вто­рая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая – порядковый но­мер фермента в его подподклассе. Например, КФ 2.7.1.1 означает, что фермент относится к классу 2 (трансфераза), подклассу 7 (пере­нос фосфата), подподклассу 1 (акцептором является спирт). Послед­няя цифра обозначает фермент гексокиназу – D-гексозо-6-фосфо-трансферазу, т. е. фермент, катализирующий перенос фосфата с АТФ к глюкозе.

Классы ферментов

Ферменты подразделяются на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы (18 подклассов).

2. Трансферазы, или феразы (8 подклассов).

3. Гидролазы (11 подклассов).

4. Лиазы, или десмолазы (6–7 подклассов).

5. Изомеразы и мутазы (5–6 подклассов).

6. Лигазы, или синтетазы (5 подклассов).

Оксидоредуктазы

Оксидоредуктазы – ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов:

S_восст + S'_окисл = S_окисл + S'_восст

Ферменты катализируют реакции, в которых участвуют такие группы, как СН–ОН, СН–СН, С=О, СН–NH₂, –СН–NН–.

В клетке окислительные процессы происходят по нескольким механизмам:

1. По типу отнятия электронов:

Aⁿ⁺ электроны A^m+

2. По типу отнятия водорода:

А₁ –2Н А₂

3. Путем присоединения к субстрату кислорода:

А₁ + О₂ А₂

Оксидоредуктазы подразделяют на дегидрогеназы, оксидазы, оксигеназы. Кроме того, в митохондриях клеток содержится группа фер­ментов – промежуточных переносчиков электронов дыхательной цепи.

Дегидрогеназы – это ферменты, отнимающие водород от одних органических веществ и передающие другим органическим соедине­ниям (анаэробные дегидрогеназы) или кислороду воздуха (аэробные дегидрогеназы).

Анаэробные дегидрогеназы содержат коферменты НАД (козимаза), НАДФ, аэробные – ФАД.

Оксигеназы – это ферменты, осуществляющие включение одно­го (оксигеназы) или двух (диоксигеназы) атомов кислорода в молеку­лу субстрата. К ним относятся ферменты, осуществляющие окисление путем передачи восстановительного эквивалента от субстрата либо на молекулярный кислород, либо на кислород пероксида водорода или органических перекисей.

К оксидазам относятся пероксидазы и полифенолоксидазы.

Пероксидазы – ферменты, окисляющие субстрат при помощи пероксида водорода:

Н₂О₂ + АН₂ → А + 2 Н₂О₂,

где АН₂, А – восстановленный и окисленный субстраты соответственно Субстратами пероксидаз служат фенолы и ароматические со­единения.

Пероксидазы – железосодержащие ферменты, гемом которых является феррипротопорфирин IX. Окисление субстратов осуществля­ется по одноэлектронному механизму. Первой стадией каталитического процесса является образование комплекса между железом фермента и пероксидом водорода. Следовательно, окисление субстрата осуще­ствляется пероксидом водорода, который активирован ферментом:

Е-Н₂О + Н₂О₂ → Е- Н₂О₂ + Н₂О

Е- Н₂О₂ + АН₂ → Соединение 2 + АН•

Соединение 2 + АН• → Е-Н₂О + А

Пероксидазы широко распространены в растительных тканях, они находятся в клеточной стенке и пероксисомах. Известно более 20 изоформ пероксидаз с различной активностью. Роль пероксидаз в биохимии и физиологии растений окончательно не выяснена. Перок­сидазы наряду с каталазой препятствуют накоплению пероксида во­дорода в клетке, выполняют защитную функцию, играют важную роль в онтогенезе растений при патогенезе, противостоянии стрессу, различных механических повреждениях. Они участвуют в нейтрали­зации продуктов вторичного обмена (фенолов), в регуляции гормо­нального статуса растений через окисление индолилуксусной кислоты, образование этилена из метионина, участвуют в процессах синтеза лигнина в клеточной стенке.

Образованные в пероксидазных реакциях активные формы кис­лорода могут использоваться растениями для защиты от патогенеза. Пероксидазы могут разрушать комплексы, содержащие радионуклеиды, препятствовать их накоплению.

Анализ ферментативной активности пероксидаз проводится фо­токолориметрическим методом при длине волны 440 нм и рабочей длине кюветы 2 см.

При окислении фенола, бензидина, гваякола, катехола и других фенольных соеди-нений определение активности пероксидазы основа­но на образовании красно-коричневых продуктов.

Общая схема реакции

пероксидаза

Фенол + Н₂О₂ Хинон + Н₂О

красно-коричневая

окраска

Полифенолоксидаза – оксидоредуктаза, катализирующая окис­ление полифенолов. Определение ее активности проводится фотоколориметрическим методом при длине волны 590 нм, рабочей длине кюве­ты 2 см, при воздействии на систему пирокатехин-p-фенилендиамин.

Полифенолоксидаза содержится в высших растениях и грибах. Массовая доля меди в данном ферменте составляет 0,2–0,3 %. Моле­кулярная масса полифенолоксидазы у грибов равна 34 500, у чайно­го листа – 144 000. Она участвует в окислении полифенолов и ду­бильных веществ, ее действием объясняется потемнение плодов и овощей при сушке, а также поверхностей разрезанных яблок или картофельных клубней.

К оксидоредуктаза м относятся также ферменты дыхательной цепи цитохромы.

Каталаза – фермент, катализирующий расщепление Н₂О₂ от­носится к классу оксидоредуктаз. Биологическая роль каталазы зак­лючается в том, что она разрушает токсичную для животных и расти­тельных клеток Н₂О₂, которая накапливается как рабочий продукт метаболизма:

каталаза

2Н₂О₂ 2Н₂О + О₂

Каталаза – двухкомпонентный фермент, состоящий из белкя и простетической группы, которая содержит гематин и связывается с белком двумя карбоксилами.

Каталаза локализуется в пероксисомах. Это быстродейству­ющий фермент, при 0 °С одна молекула каталазы разлагает до 40 000 молекул Н₂О₂ в секунду. Каталаза ингибируется синильной кислотой

Трансферазы

Трансферазы – ферменты, катализирующие перенос группы от субстрата S к субстрату S':

S – G + S' → S' – G + S

Ацилтрансферазы – ферменты, переносящие ацильные группы R–СО– (например, ацетил СН₃СО–):

Ацетил-СоА + Холин → СоА + Ацетилхолин

Алкилтрансферазы – ферменты, переносящие алкильные груп­пы (например, метилтрансферазы переносят СН₃–).

Фосфотрансферазы – ферменты, переносящие группы, содер­жащие фосфор.

Гликозилтрансферазы – ферменты, катализирующие перенос остатков моносахаридов. К ним относятся фосфорилазы. Представи­телем фосфорилаз является крахмальная фосфорилаза (α-глюкан-фосфорилаза, КФ2.4.1.1).

Гидролазы

Гидролазы – это ферменты, катализирующие процессы гидро­лиза (гидролиз эфирных, сложноэфирных, пептидных и гликозильных связей, кислотных ангидридов, связей С–С, С–галоида, Р–N).

Гидролазы подразделяются на эстеразы, карбогидразы, протеазы, амидазы, дезаминазы, фосфорилазы и др.

Эстеразы – ферменты, катализирующие реакции расщепления и синтеза сложных эфиров:

эстеразы

R–СО–О–R₁ + Н₂О R–СООН + R,ОН

К ним относятся липазы, танназы, хлорофиллазы, пектинэстера-зы (пектазы), фосфатазы, сульфатазы.

Танназы – ферменты, катализирующие гидролиз сложного эфира таннина.

Хлорофиллазы – это эстеразы, катализирующие переэтерификацию хлорофилла.

Пектазы катализируют гидролиз эфиров пектина. фосфатазы ускоряют расщепление и синтез сложных эфиров, об­разованных спиртами и фосфорной кислотой. Они подразделяются на фосфатазы неспецифического и специфического действия. Неспецифи­ческие фосфатазы катализируют отщепление Н₃РО₄ от фосфорных эфи­ров, для них характерен широкий диапазон рН (4,5-9,0). К ним относят­ся рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза, катализирующие распад рибонуклеиновой и дезоксирнбонуклеиновой кислот. Специфические фос­фатазы действуют на фосфорные эфиры определенного состава. К ним относится фруктозодифосфатаза, действующая только на фруктозодифосфорную кислоту. Сульфатазы катализируют гидролиз и синтез слож­ных эфиров серной кислоты.

К карбогидразам относятся ферменты, катализирующие гидро­лиз и синтез гликозидов, олиго- и полисахаридов. Карбогидразы под­разделяются на олигазы и полиазы. Полиазы — ферменты, катализи­рующие гидролиз полисахаридов, а олигазы — гидролиз олигосахаридов.

Олигазы

К олигазам относятся α-глюкозидаза, (3-глюкозидаза, α-галактозидаза, β-галактозидаза, β-фруктофуранозидаза.

α-Глюкозидаза, или мальтаза – фермент, расщепляющий α -глюкозидную связь в дисахаридах и глюкозидах. Биологическим субстратом для данного фермента являются мальтоза и сахароза. Содержится в тканях растений, плесневых грибах, дрожжах, бактери­ях, проросшем просяном зерне. Просяной солод применяют как до­бавку к ячменному солоду при изготовлении мальтозной патоки, так как он богат активной мальтазой.

β-Глюкозидаза – фермент, расщепляющий β-глюкозидную связь в ди- и полисахаридах, β-глюкозидах (глюкозиды – амигдалин, арбутин)

α-Галактозидаза – фермент, катализирующий гидролиз α-галактозидов, например рафинозы и мелибиозы. Этот фермент содержится в пивных дрожжах и грибном солоде, например в такадиастазе -ферментном препарате, полученном из плесневых грибов.

β-Галактозидаза (КФ 3.2.1.23), или лактаза, – фермент, катали­зирующий гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу; содержится в бактериях, плесневых грибах, плодах миндаля, в лактозных дрож­жах, в молочных железах животного организма.

β-фруктофуранозидаза (КФ 3.2.1.26), или сахараза, или инвертаза, – фермент, катализирующий расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу.

α-Глюкозидаза гидролизует сахарозу у α-глюкозидного С-атома остатка глюкозы, а β-фруктофуранозидаза гидролизует связь у β-глюкозидного С-атома остатка фруктозы. β-фруктофуранозидаза (сахараза) также гидролизирует рафинозы (триозы) с образованием молекулы фруктозы и молекулы дисахарида мелибиозы.

Полиазы

Одной из полиаз является амилаза, которую называют также птиалином, или диастазой. Амилаза была открыта в 1814 г. К.С. Кирхгофом. Содержится в слюне, панкреатическом соке, плесне­вых грибах, проросшем зерне; гидролизует крахмал до декстринов и мальтозы. Амилазы гидролизуют крахмальные зерна и крахмаль­ный клейстер. Установлено существование трех амилаз: α-амилазы, β-амилазы и γ-амилазы (глюкоамилазы).

α-Амилаза (КФ 3.2.1.1) (другие названия птиалин, декстриногеноамилаза, гликогеназа) – содержится в слюне, в проросших зернах пшеницы, ржи, ячменя.

β-Амилаза (КФ 3.2.1.2.), или сахарогеноамилаза, содержится в зернах пшеницы, ржи, ячменя, соевых бобах.

α- и β-Амилазы различаются по характеру действия на компо­ненты крахмала – амилозу и амилопектин.

β-Амилаза расщепляет амилозу на 100 % до мальтозы, амило­пектин – на 54 % до мальтозы и на 46 % – до декстринов, дающих с йодом красно-коричневое окрашивание. Данные декстрины гидролизуются α-амилазой до декстринов с меньшей молекулярной массой, не дающих окрашивания с йодом, с образованием незначительного количества мальтозы.

Декстрины, образовавшиеся при действии β-амилазы на амилопектин гидролизуются α-амилазой с образованием декстринов, обладающих меньшей молекулярной массой и дающих окрашивание с йодом.

Пои последующем длительном действии α-амилазы на крахмал 85% его превращается в мальтозу. Таким образом, при действии на крахмал β-амилазы образуется в основном мальтоза и незначительное количество высокомолекулярных декстринов. При действии на крахмал α-амилазы образуются в основном декстрины меньшей мо­лекулярной массы и незначительное количество мальтозы.

Оптимум рН β-амилазы – 4, α-амилазы – 5,5.

Так как активность α-амилазы снижается при повышении кис­лотности, тесто из муки, полученной из проросшего зерна, замешива­ют на жидких дрожжах (молочнокислых заквасках); молочная кисло­та угнетает действие α-амилазы.

α-Амилаза более устойчива к действию повышенных темпера­тур, ее температурный оптимум (68 °С) выше температурного опти­мума β-амилазы (52 °С).

Семена растений отличаются содержанием α- и β-амилазы. Так, β-амилаза содержится в непроросших семенах пшеницы, ржи и ячменя, α-амилаза образуется лишь при прорастании. В непророс­ших и проросших соевых бобах присутствует только β-амилаза. В непроросших семенах сорго содержится α-амилаза.

Инактиваторы амилазы – белки и дубильные вещества – служат регулирующим фактором в прорастающем и созревающем зерне.

Солод, применяемый при изготовлении пива и осахаривании карто­фельных или мучных заторов в спиртовой промышленности, является ис­точником активной амилазы, превращающей крахмал в сбраживаемый сахар – мальтозу. Активный грибной солод получают из плесневых грибов.

Глюкоамилаза (КФ 3.2.1.3) – фермент, гидролизующий крахмал с образованием глюкозы и небольшого количества декстринов. Полу­чают из плесневых грибов и используют для производства кристал­лической глюкозы и глюкозной патоки.

Целлюлоза – комплекс двух ферментов: эндоглюканазы (КФ 3.2.1.4) и экзоглюканазы (КФ 3.2.1.74). Гидролизует клетчатку с образованием целлобиозы. Целлюлаза содержится в проросшем зерне, бактериях и плесневых грибах, является активным ферментом в грибах-вредителях, живущих на древесине.

Бактерии, живущие в желудках травоядных животных, выделяют активную целлюлазу, которая гидролизует клетчатку. Этим объяс­няется способность животных переваривать и усваивать клетчатку.

Инулиназа (КФ 3.2.1.7), или инулаза, – фермент, гидролизующий инулин с образованием фруктозы. Обнаружена в высших растениях, содержащих большое количество инулина, и плесневых грибах.

Гемицеллюлазы – группа ферментов, гидролизующих различные гемицеллюлозы. Последние содержатся в прорастающих семенах и плесневых грибах. Например, ксиланаза (КФ 3.2.1.32) гидролизует ксиланы до ксилозы.

Тротопектиназа и Полигалактуроназа (пектиназа) – фермен­ты, расщепляющие пектиновые вещества. Протопектиназа – фермент разрушающий связи между метоксилированной полигалактуроновои кислотой и арабаном или галактаном. Эта кислота (растворимый пек­тин) гидролизуется пектинэстеразой до метилового спирта и полига­лактуроновои кислоты. Полигалактуроназа катализирует гидролиз по­лигалактуроновои кислоты. Полигалактуроназа характерна для бактерий и плесневых грибов, в высших растениях встречается редко (пока об­наружена только в плодах томатов). Плесневые грибы используются для получения препаратов данных ферментов, которые применяются в пищевой промышленности для осветления фруктовых соков, плодо­вых и виноградных вин, содержащих большое количество растворимо­го пектина.

Протеазы (протеолитические ферменты) – это ферменты, ка­тализирующие гидролиз белков, полипептидов, олигопептидов. Под­разделяются на протеиназы (полипептидазы) и пептидазы.

Протеиназы (полипептидазы) осуществляют гидролиз белков и высокомолекулярных полипептидов. Пептидазы расщепляют низ­комолекулярные пептиды (тетра-, три- и дипептиды).

По воздействию на конкретные участки пептидной цепи протеоли­тические ферменты делятся на эндопептидазы (действуют на участки цепи, расположенные далеко от ее концов) и экзопептидазы (отщепля­ют концевые аминокислоты). Примерами экзопептидаз являются кар-бокси- и аминопептидазы.

В зависимости от строения активного центра протеолитических ферментов выделяют следующие протеиназы:

- сериновые, содержащие в активном центре серии (трипсин, химотрипсин);

- тиоловые, содержащие в активном центре цистеин (катепсин В),

- кислые, содержащие в активном центре две –СООН-группы (пепсин, катепсин Д).

Протеолитические ферменты подразделяются на ферменты желудочно-кишечного тракта, тканевые и бактериальные.

Пезамидазы (амидазы) – гидролазы, катализирующие процессы дезминирования амидов кислот с образованием NH₃ и кислоты. К амидазам относятся аргиназа, уреаза, аспарагиназа, глутаминаза. Аргиназа – фермент печени, катализирует гидролиз аргинина с образованием мочевины и орнитина. Уреаза - фермент, катализирующий гидролиз мочевины с образованием NH₃ и СО₂. Аспарагиназа дезаминирует аспарагин, глутаминаза – глутамин.

Дезаминазы катализируют процессы дезаминирования азотистых оснований (аденин, гуанин) с образованием спиртов и аммиака. Гуаназа и аденилаза катализируют дезаминирование гуанина и адениловой кислоты.

В растительной клетке гидролитические ферменты локализова­ны в вакуолях, отделенных от цитоплазмы белково-липидной мемб­раной – тонопластом.

Лиазы

Лиазы (десмолазы) – ферменты, отщепляющие группы от суб­стратов по негидролитическому механизму с образованием двойных связей.

К лиазам относятся ферменты, действующие на связи С–С, С–О, С–N, С–S, С–галоид (альдолаза, декарбоксилаза).

Молекула рибулозодифосфаткарбоксилазы включает 16 субъединиц: восемь больших, образующих активный центр, синтезируются в хлоропласте, восемь малых – синтезируются в цитоплазме, транспортируются через мембрану хлоропласта и соединяются с большими субъединицами. Молекулярная масса фермента, выделенного из листьев шпината, равна 550 000. Содержание рибулозодифосфаткарбоксилазы составляет в среднем 16 % от общей массы белка в листьях.

Изомеразы и мутазы

Изомеразы – ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических, геометрических и позиционных изомеров. Мутазы обеспечивают внутримолекулярный перенос атомных группировок без образования изомера.

К изомеразам относятся цис-транс-изомеразы, например:

ретинальизомераза

Транс-ретиналь————————> 11-цис-ретиналь

Подклассом изомераз являются изомеразы, катализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз.

Лигазы

Лигазы (от лат. ligare – связывать), или синтетазы, – фермен­ты, катализирующие соединение двух молекул, сопряженное с разры­вом пирофосфатной связи АТФ. К данному классу относятся фер­менты, катализирующие реакции, в ходе которых образуются связи С–О, С–S, С–N, С–С.