 ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ Сила воли ведет к действию, а позитивные действия формируют позитивное отношение Как определить диапазон голоса - ваш вокал Игровые автоматы с быстрым выводом Как самому избавиться от обидчивости Противоречивые взгляды на качества, присущие мужчинам Вкуснейший "Салат из свеклы с чесноком" Натюрморт и его изобразительные возможности Применение, как принимать мумие? Мумие для волос, лица, при переломах, при кровотечении и т.д. Как научиться брать на себя ответственность Зачем нужны границы в отношениях с детьми? Световозвращающие элементы на детской одежде Как победить свой возраст? Восемь уникальных способов, которые помогут достичь долголетия Классификация ожирения по ИМТ (ВОЗ) Глава 3. Завет мужчины с женщиной
Оси и плоскости тела человека - Тело человека состоит из определенных топографических частей и участков, в которых расположены органы, мышцы, сосуды, нервы и т.д.
| Разделение белков путем адсорбции
Белки обладают способностью избирательно адсорбироваться на твердых фазах. Поэтому для разделения белков широко используются адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография (рис. 1.2.4). Применение этих методов позволяет получить наибольшую степень очистки белков. Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники. Белки связываются ионообменником с помощью электростатических сил между заряженными поверхностями белков и кластерами заряженных групп на ионообменнике. При разделении белков и их анализе используется жидкостная хроматография. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ с помощью тока элюирующей (вымывающей) жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам.
Рис. 1.2.4. Схема колоночной адсорбционной хроматографии. Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью. 1 – нанесение образца на колонку; 2 – середина опыта; 3 – окончание опыта. При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона с разделяемой смесью. Основной принцип хроматографического разделения приведен на рис. 1.2.5.
Рис. 1.2.5. Основной принцип хроматографического разделения: НФ – слой неподвижной фазы, покрывающей внутреннюю поверхность капиллярной трубки Т, через которую течет подвижная фаза (ПФ). Компонент А1 разделяемой смеси обладает большим сродством к подвижной фазе, а компонент А2 – к неподвижной фазе. А'1 и А'2 – положения зон тех же компонентов через промежуток времени, за которое происходило хроматографическое разделение в направлении, указанном стрелкой.
Выбор ионообменника Выбор ионообменника определяется изоэлектрической точкой выделяемого белка. При значениях рН буфера ниже изоэлектрической точки белок имеет положительный заряд и адсорбируется на катионообменнике и, наоборот. Обычно условия адсорбции выбирают эмпирически, так как чаще всего изоэлектрическая точка белка неизвестна, хотя ее можно определить путем изоэлектрического фокусирования. На рис. 1.2.6 представлено схематическое изображение частицы ионообменной смолы.
Рис. 1.2.6. Изображение структуры частицы ионообменной смолы. Черные кружки – заряженные функциональные группы, ковалентно связанные с нитями решетки; белые кружки – свободно перемещающиеся противоположно заряженные противоионы, электростатически связанные с частицей смолы, способные претерпевать обмен с другими ионами.
Элюция адсорбированного белка Элюцию белков с колонки можно осуществить изменением рН буфера до величины, при которой связывание белков с адсорбентом ослабевает, кроме того, повышением ионной силы буфера, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом.
Аффинная хроматография При аффинной хроматографии используют иммобилизованный на адсорбенте лиганд, осуществляющий специфический отбор белков, связывающихся с этим лигандом. После адсорбции фермент либо элюируют неспецифически (повышением концентрации соли) либо специфически (замещением белка лигандом) из раствора. Гидрофобная хроматография Метод гидрофобной хроматографии основан на связывании гидрофобного участка на поверхности белковой глобулы с алифатической цепью адсорбента. Гидрофобные взаимодействия усиливаются с повышением концентрации соли. При высаливании основной причиной агрегации является усиление гидрофобных взаимодействий между белками – при высоких концентрациях соли большинство белков будут адсорбироваться на гидрофобных группах, связанных с матрицей. Элюцию белков проводят с понижающимся градиентом концентрации соли. Белки, которые прочно адсорбируются, обычно удаляют с колонки добавлением в элюирующий раствор этиленгликоля.
|
