ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ

Оси и плоскости тела человека - Тело человека состоит из определенных топографических частей и участков, в которых расположены органы, мышцы, сосуды, нервы и т.д.

Отёска стен и прирубка косяков - Когда на доме не достаёт окон и дверей, красивое высокое крыльцо ещё только в воображении, приходится подниматься с улицы в дом по трапу.

Дифференциальные уравнения второго порядка (модель рынка с прогнозируемыми ценами) - В простых моделях рынка спрос и предложение обычно полагают зависящими только от текущей цены на товар.

Преимущества и ограничения при использовании метода CGH

1 23

Метод сравнительной геномной гибридизации имеет ряд преимуществ перед другими методами молекулярно-цитогенетического анализа. Для проведения M-FISH, SKY, RxFISH и MCB необходимо наличие препаратов метафазных хромосом пациента, в то время как для проведения CGH достаточно иметь образец геномной ДНК анализируемых клеток. В качестве источников анализируемой геномной ДНК могут быть использованы клетки тканей спонтанных абортусов и опухолей (замороженных, фиксированных в формалине или спирте). Возможность исследовать архивные образцы опухолей с помощью метода CGH позволяет проводить ретроспективный анализ многих злокачественных образований, клиническая картина которых хорошо описана. Эти достоинства и обуславливают широкое использование CGH для анализа хромосомных нарушений при онкологических заболеваниях, а также диагностики тяжелых наследственных синдромов [1, 21]. CGH может использоваться и в пренатальной диагностике [28]. Теоретически возможно использование CGH и в доимплантационной диагностике, но время, необходимое для получения ДНК-пробы и проведения гибридизации in situ, делает традиционную CGH в этом случае практически бесполезной.

Метод сравнительной геномной гибридизации также может использоваться для идентификации материала и определения происхождения малых сверхчисленных маркерных хромосом. С помощью метода можно установить наличие или отсутствие эухроматина в маркерных хромосомах при условии, что размеры эухроматинового района будут не менее 10-20 млн пар оснований.

Еще одним преимуществам метода CGH над другими методами молекулярно-цитогенетического анализа является его способность более точно идентифицировать границы и точки разрывов при таких хромосомных перестройках, как частичные моно – и трисомии. Купчик с соавторами подробно описал в своей работе несбалансированный кариотип у пациента с частичной моносомией по 18p и частичной трисомией по дистальной части короткого плеча хромосомы 16 человека [15].

Хромосомные нарушения, представляющие дупликацию или делецию определенных районов, определяются этим методом только в том случае, если величина измененного района довольно велика – 10-20 млн пар оснований [11]. Поэтому перестройки меньших размеров (микроделеционный синдром, сверхчисленная маркерная хромосома небольших размеров) идентифицировать с помощью CGH не удастся. Это, безусловно, является ограничением применения сравнительной геномной гибридизации.

При проведении сравнительной геномной гибридизации существует критические этапы, которые могут существенно повлиять на результаты [17]. К критическим моментам при проведении метода можно отнести следующие: приготовление цитологических препаратов метафазных хромосом, возможность контаминации при выделении и амплификации ДНК анализируемого образца, проведение CISS-гибридизации, цифровая обработка изображений и анализ результатов. Цитологические препараты метафазных хромосом должны отвечать ряду требований для эффективной гибридизации in situ: высокий митотический индекс, максимально расправленные, распластанные отдельно друг от друга метафазные хромосомы, отсутствие цитоплазмы, окружающей метафазные пластинки, малое количество интерфазных ядер. Цитологические препараты, не обладающие вышеперечисленными характеристиками, в диагностике не используются [12]. Возможный риск контаминации, как при выделении ДНК, так и при ее амплификации представляет отдельную проблему проведения CGH, особенно если количество исследуемой ДНК ограничено. При выделении ДНК из опухолевых клеток возможна контаминация клетками нормальной ткани, также само злокачественное образование может быть гетерогенным [10]. При исследовании спонтанных абортусов может возникнуть контаминация материнской ДНК, когда ДНК выделяется из образцов, которые помимо клеток амниотической оболочки и/или ворсин хориона содержат клетки материнской децидуальной оболочки [19]. При последующей амплификации выделенной исследуемой ДНК с помощью DOP-PCR контаминация может возникнуть при наличии ДНК хозяина фермента [22] или при образовании избыточного количества димеров праймеров [30]. Для супрессии повторенных последовательностей ДНК в CGH должно использоваться достаточное количество Cot1 ДНК. Блокированные при гибридизации c Cot1 ДНК районы хромосом исключаются из анализа. Таким образом исключаются короткие плечи акроцентрических хромосом и центромерные районы хромосом 1, 9, 16. Отношения профилей флуоресценции для дистальной части короткого плеча хромосомы 1, коротких плечей хромосом 16 и 19 могут значительно варьировать даже в норме, поэтому они также исключаются из анализа [9, 13].

Правильная интерпретация результатов способствует более точной и верной идентификации несбалансированных хромосомных аберраций. В зависимости от выбора уровня достоверности варьирует чувствительность метода. Правильному выбору способствует проведение CGH с участием меченых ДНК нормальных образцов мужчины и женщины на метафазные хромосомы здорового донора [13].

CGH не способна определять степень мозаицизма, плоидность клеток, сбалансированные хромосомные перестройки, такие как инверсии, транслокации и несбалансированные перестройки размером менее 10-15 млн пар оснований [23]. Сбалансированные перестройки (инверсии и транслокации) характерные для гематологических и мезенхимальных опухолей, следовательно, не могут быть идентифицированы с помощью CGH [10]. В случае мозаицизма проблематичным является определение хромосомных аберраций размером около 15 млн пар оснований, даже если они представлены в 50% клеток исследуемого образца. Таким образом, чувствительность метода в случае мозаицизма зависит как от доли клеток с хромосомными изменениями, так и от размера измененного района хромосомы.

Microarray-CGH

Перспективы развития и усовершенствования метода CGH связаны с поиском подходов, предназначенных для устранения существующих ограничений. Одним из основных недостатков CGH является его неспособность детектировать несбалансированные перестройки с размером не менее 10-20 млн пар оснований. Увеличение разрешающей способности данного метода позволило бы существенно расширить область его применения для научных и диагностических целей.

Солинас-Толдо впервые предложила заменить цитологический препарат метафазных хромосом, как мишень для гибридизации, на подложку с нанесенными на нее наборами иммобилизованных фрагментов ДНК [27]. Этот подход был назван M-CGH (Matrix-CGH) или microarray-CGH. Принцип метода microarray-CGH почти такой же, как и в CGH: совместно денатурированные ДНК-пробы исследуемой и контрольной ДНК наносятся на микрочипы, состоящие из ДНК-мишеней определенного размера, иммобилизованных на подложке в виде матрицы (рис.3). Фрагменты ДНК для создания такой матрицы могут быть клонированы в космидах, в векторах, созданных на основе бактериофага P1 (P1-derived artificial chromosomes или PACs), искусственных хромосомах бактерий (ВАС) или дрожжей (Yeast Artificial Chromosomes - YAC). Разрешение этого метода существенно возрастает относительно традиционной CGH. Разработаны микрочипы, обеспечивающие разрешение до 1 млн пар оснований, и даже до 100 тыс пар оснований [26]. Это значительно превышает таковую у стандартной CGH. Кроме того, microarray-CGH позволяет избежать таких трудоемких этапов, как идентификация метафазных хромосом, дает меньше ложноположительных и ложноотрицательных результатов. К преимуществам microarray-CGH можно отнести также автоматизацию основной части процедур, возможность анализа не только нарушения баланса хромосомных районов, но и изменения экспрессии генов.

В настоящее время microarray-CGH уже используется для скрининга хромосомных аберраций при генетических болезнях, таких как синдром Ангельмана или синдром Прадер-Вилли, анеуплоидий в предимплантационной диагностике [16], несбалансированных перестроек генома в пренатальной диагностике, определении происхождения и состава малых сверхчисленных маркерных хромосом, анализа изменений числа копий ДНК в опухолях и опухолевых клеточных линиях для идентификации генов, вовлеченных в развитие и патогенез злокачественных образований [18, 25].

Ограничением использования этого метода, так же как и в стандартной CGH является его неспособность к диагностике сбалансированных хромосомных перестроек (инверсии, сбалансированные транслокации) и ограничение в определении мозаицизма (как минимум доля клеток с хромосомными нарушениями должна составлять 50%).

Литература

1. Albertson DG, Collins C, McCormick F, Gray J. Chromosome aberrations in solid tumors // Nature Genetics, 2003, 34, №4, p.369-376.

2. Bagnell Jr CR. Laser Capture Microdissection. In: Molecular Diagnostics, Second Edition For the Clinical Laboratorian 2007, ed. by William B. Coleman and Gregory J. Tsongalis © Humana Press Inc., Totowa, NJ, p. 219-224.

3. Callagy G, Jackson L, Caldas C. Comparative genomic hybridization using DNA from laser capture microdissected tissue // Methods Mol. Biol, 2005, 293, p.39-55.

4. du Manoir S, Speicher MR, Joos S, Schröck E, Popp S, Döhner H, Kovacs G, Robert-Nicoud M, Lichter P, Cremer T. Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization // Hum Genet, 1993, 90, p.590-610.

5. du Manoir S, Schröck E, Bentz M, Speicher MR, Joons S, Hied T, Lichter P, Cremer T. Quantitative analysis of comparative genomic hybridization // Cytometry, 1995, №19, p.27-41.

6. du Manoir S, Kallioniemi O-P, Lichter P, Piper J, Benedetti PA, Carothers AD et al. Hardware and software requirements for quantitave analysis of comparative genomic hybridization // Cytometry, 1995, №19, p.194-199.

7. Espina V, Wulfkuhle JD, Calvert V, VanMeter A, Zhou W, Coukos G, Geho DH, Petricoin III EF, Liotta LA. Laser-capture microdissection // Nature Protocols, 2006, 1, p.586-603.

8. Fuller AP, Palmer-Toy D, Erlander MG, and Sgroi DC. Laser Capture Microdissection and Advanced Molecular Analysis of Human Breast Cancer // Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, 2003, 8, 3, p. 335-345.

9. Halder A, Halder S, Fauzdar A. A preliminary investigation of genomic screening in cervical carcinoma by comparative genomic hybridization // Indian J. Med. Res, 2005, №122, p.434-446.

10. Hermsen MAJA, Meijer GA, Baak JPA et al. Comparative genomic hybridization a new tool in cancer pathology // Hum.Pathol, 1996, 27, p.342-349.

11. Kallioniemi A, Kallioniemi O-P, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors // Science. 1992, 258, p.818-821.

12. Karhu R, Kähkönen M, Kuukasjävi T, Pennanen S, Tirkkonen M, Kallioniemi O. Quality сontrol of CGH: impact of metaphase chromosomes and the dynamic range of hybridization // Cytometry, 1997, №28, p.198-205.

13. Kirchhoff M, Gerdes T, Rose H, Maahr J, Ottesen AM, Lundsteen C. Detection of chromosomal gains and losses in comparative genomic hybridization analysis based on standard reference intervals // Cytometry, 1998, 31, p.163-173.

14. Kolble K. The LEICA microdissection system: Design and applications // J. Mol. Med, 2000, 78, B24-B25.

15. Kuphick GS, Barrett SK, Babu A, Charra-Ortiz G, Velinov M, Macera MI. Atypical 18p- syndrome associated with partial trisomy 16p in a chromosomally inbalanced child of consaguineous parents with an identical balanced translocation // European J. of Med. Genetics, 2005, 48, №1, p.57-65.

16. Le Caignec C, Spits C, Sermon K, De Rycke M, Thienpont B, Debrock S, Staessen C, Moreau Y, Fryns J-P, Van Steirteghem A, Liebaers I, Vermeesch JR. Single-cell chromosomal imbalances detection by array CGH // Nucl. Acids Research, 200, 34, № 9.e68.

17. Lichter P, Bentz M, Du Manoir S, Joos S. Comparative genomic hybridization // Human chromosomes. Principles and techniques, p.191-210.

18. Little SE, Vuononvirta R, Reis-Filho JS, Natrajan R, Iravani M, Fenwick K, Mackay A, Ashworth A, Pritchard-Jones K, Jones C. Array CGH using whole genome amplification of fresh-frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tumor DNA // Genomics, 2006, 87, №2, p.298-306.

19. Lomax B, Tang S, Separovic E, Phillips D, Hillard E, Thomson T, Kalousek DK. Comparative genomic hybridization in combination with flow cytometry improves results of cytogenetic analysis of spontaneous abortions // Am. J. Hum. Genet, 2000, 66, № 5, p.1516-1521.

20. Lundsteen C, Maahr J, Christensen B, Bryndorf T, Bentz M, Lichter P, Gerdes T. Image analysis in comparative genomic hybridization, // Cytometry, 1995, 19, p.42-50.

21. Ness GO, Lyback H, Houge G. Usefulness of high-resolution comparative genomic hybridization (CGH) for detecting and characterizing constitutional chromosome abnormalities // Am. J. of Med. Genetics, 2002, №113, p.125-136.

22. Newsome T, Li B-J, Zou N, Lo S-C. Presence of bacterial phage-like DNA sequences in commercial Taq DNA polymerase reagents // Journal of clinical microbiology, 2004, 42, №5. p.2264-2267.

23. Oostlander AE, Mejer GA, Ylstra B. Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics // Clin. Genet, 2004, № 66, p.488-495.

24. Piper J, Rutovitz D, Sudar D, Kallioniemi A, Kallioniemi O-P, Waldman FM, Gray JW, Pinkel D. Computer image analysis of comparative genomic hybridization // Cytometry, 1995, №19, p.10-26.

25. Rickman L, Fiegler H, Carter NP, Bobrow M. Prenatal diagnosis by array-CGH // European Journal of Medical Genetics, 2005, №48, p.232-240.

26. Sanlaville D, Lapierre J-M, Turleau C, Coquin A, Borck G, Colleaux L, Vekemans M, Romana SP. Molecular karyotyping in human constitutional cytogenetics // European Journal of Medical Genetics, 2005, № 48, p.214-231.

27. Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A, Dohner H, Cremer T, Lichter P. Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalances // Genes, Chromosomes & Cancer, 1997, 20, p.399-407.

28. Voullaire L, Slater H, Williamson R, Wilton L. Chromosome analysis of blastomeres from human embryos by using comparative genomic hybridization // Hum Genet, 2000, №106, p.210-217.

29. Weiss M.M, Hermsen MAJA, Meijer GA, van Grieken NCT, Baak JPA, Kuipers EJ, van Diest PJ. Comparative genomic hybridization // J. Clin. Pathol: Mol. Pathol, 1999, 52, p.243–251.

30. Wesley CS, Ben M, Kreitman M, Hagag N, Eanes WF. Cloning regions of the Drosophila genome by microdissection of polytene chromosome DNA and PCR with nonspecific primer // Nucleic Acids Research, 1989, 18, №3, p.599-603.

Подписи к рисункам

Рисунок 1. Принципиальная схема проведения сравнительной геномной гибридизации.

Рисунок 2. Сегментационная маска и схема измерения интенсивности сигнала для определения отношения ФС: а – окраска красителем DAPI; б – сигнал FISH контрольной ДНК-пробы; в - сигнал FISH ДНК-пробы анализируемого образца.

Рисунок 3. Принципиальная схема проведения microarray-CGH

1 23