ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ

Оси и плоскости тела человека - Тело человека состоит из определенных топографических частей и участков, в которых расположены органы, мышцы, сосуды, нервы и т.д.

Отёска стен и прирубка косяков - Когда на доме не достаёт окон и дверей, красивое высокое крыльцо ещё только в воображении, приходится подниматься с улицы в дом по трапу.

Дифференциальные уравнения второго порядка (модель рынка с прогнозируемыми ценами) - В простых моделях рынка спрос и предложение обычно полагают зависящими только от текущей цены на товар.

Получение ДНК- проб для проведения CGH.

123

Наиболее серьезной проблемой при получении ДНК-проб для проведения CGH является изоляция материала для последующего выделения ДНК. Например, при анализе клеток опухоли контаминация выделенного материала нормальными клетками приводит к выравниванию уровня сигнала в районах нарушенного баланса, и, как следствие, к ошибочным выводам. В связи с этим на данном этапе работы требуется опытный патоморфолог. Если в прошлые годы для диссекции опухолевых клеток из среза были необходимы не только глаза опытного специалиста, но и очень умелые руки, то развитие технологии лазерной микродиссекции превратило процедуру диссекции в несложную для оператора операцию, напоминающую компьютерную игру. Техника лазерной микродиссекции и специализированное оборудование разработаны фирмами ZEISS, LEICA, Olympus и т.д.. Они отличаются не только мелкими деталями, но и принципиальными подходами в переносе вырезанного фрагмента. Однако, все они обеспечивают точную диссекцию интересующего исследователя материала, и его бесконтактный перенос в специальные ловушки [2, 7, 14]. С возможностями этой техники можно ознакомиться на многочисленных Web-сайтах этих фирм и пользователей данного оборудования.

Стандартная процедура выделения ДНК из малых образцов, с последующей DOP-PCR (см. главу 1.4. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе хромосомных аномалий) и введение метки в дополнительных циклах полимеразной цепной реакции позволяют за один день получить необходимые ДНК-пробы. Несмотря на наличие многочисленных протоколов, вероятно, все-таки следует подробнее остановиться на получении геномных ДНК-проб, используемых при CGH. В большинстве случаев при проведении FISH качество ДНК-пробы считается тем выше, чем большая доля ДНК хромосомы или хромосомного района входит в ее состав. В случае CGH это не совсем верно. Рассмотрим подробнее характеристики ДНК-проб, влияющие на интенсивность сигнала после проведения FISH. По нашим оценкам, если в состав ДНК-пробы входит около 10% последовательностей ДНК хромосомы, этого вполне достаточно для ее ровного «окрашивания» в результате супрессионной FISH. Будем считать это исходной точкой и представим, что на старте DOP-PCR ДНК соответствующей хромосомы было в два раза больше. При той же эффективности ее вовлечения в амплификацию следует ожидать, что в состав ДНК-пробы войдет 19% последовательностей ДНК этой хромосомы. Процент последовательностей ДНК, вовлеченных в амплификацию в этом случае будет равен 10% + 10% - 1% (последовательности, вовлеченные в амплификацию дважды). Таким образом, за счет увеличения представленности ДНК в полученной ДНК-пробе при увеличении на старте DOP-PCR количества ДНК в два раза следует ожидать увеличения интенсивности сигнала в 1,9 раза. Еще небольшое увеличение можно ожидать в результате увеличения в два раза числа копий 1% последовательностей. Однако, при гибридизации in situ они будут конкурировать за одни и те же сайты, что при высокой концентрации меченой ДНК практически не даст увеличения сигнала. Тем не менее, при увеличении числа копий хромосом или их районов на один геном в два раза при рассмотренной эффективности DOP-PCR следует ожидать увеличение интенсивности сигнала супрессионной FISH в 1,9 раза. В случае трисомии увеличение сигнала будет в 1,45 раза относительно нормы. Такие исходные условия позволят достаточно хорошо отслеживать нарушение в клетке баланса хромосом или хромосомных районов.

Что произойдет, если исследователю удастся значительно увеличить эффективность DOP-PCR или он использует ник-трансляцию для мечения выделенной ДНК? Рассмотрим вариант, когда в состав ДНК-пробы входит 90% последовательностей ДНК интересующей хромосомы. В этом случае двукратное увеличение матрицы на старте DOP-PCR приведет к увеличению процента последовательностей ее ДНК до 99% (90% + 90% - 81%). Т.е., можно ожидать увеличения сигнала в 1,1. В случае трисомии увеличение интенсивности сигнала будет в 1,05 раза относительно нормы, что оказывается далеко за пределами возможностей современных методов регистрации изменения уровня интенсивности сигнала.

Мы рассмотрели примеры проведения гибридизации in situ при значительном избытке ДНК-пробы и убедились, что в этих условиях использование «очень хороших» ДНК-проб оказывается не эффективным. Однако, разница в интенсивности сигнала на хромосоме или ее районе в зависимости от наличия в ДНК-пробе разного числа копий одних и тех же последовательностей проявится при более низких концентрациях меченой ДНК при проведении FISH, и этот феномен также может быть использован в CGH.

Для проведения CGH качество ДНК-пробы (доля последовательностей ДНК хромосомы или ее района, присутствующая в ДНК-пробе, уровень мечения), как мы убедились, имеет принципиальное значение. Оно во многом зависит от метода ее получения. В первых работах, выполненных в начале 90-х годов, мечение ДНК проводили методом ник-трансляции. Это требовало достаточно выделения большого количества ДНК, но обеспечивало практически полное мечение ДНК с достаточно высоким уровнем включения метки. В связи с этим при использовании таких ДНК-проб было необходимо выявлять разницу в числе копий одинаковых последовательностей ДНК. Для оценки возможности их использования полезно рассмотреть результаты, полученные в ряде модельных экспериментов [4]. В качестве зондов авторы использовали меченные ник-трансляцией (введение биотина и дигоксигенина) pBS-библиотеки, созданные из материала сортированных на проточном цитометре хромосом человека 4, 8, 13 и 16. В экспериментах, где хромосомы метили раздельно, а затем смешивали в разных соотношениях (1/64, 1/16, 1/4, 1/1, 4/1, 16/1, 64/1), ожидаемые и наблюдаемые отношения интенсивностей сигналов отличались сильно, но уровень воспроизведения результатов был не достаточно высоким, что было списано авторами на ошибки при смешивании ДНК-проб (“The accuracy with which such mixtures could be produced for individual chromosomes in repeated experiments, however, was not satisfactory in our hands” [4]). Тем не менее, при использовании ими CGH для анализа хромосомных аномалий в клеточных линиях полученные результаты полностью соответствовали результатам рутинной хромосомной диагностики, выполненной на метафазных хромосомах. В этом случае ДНК-пробы также получали, используя для мечения ДНК ник-трансляцию. Необходимо обратить внимание на количество меченой ДНК, используемой для FISH с супрессией гибридизации повторенных последовательностей добавлением Cot1 ДНК. Авторы брали в эксперимент по 1 мкг ДНК каждой пробы. Т.е., на среднюю по размеру хромосому приходилось около 50 нг. Это примерно в десять раз меньше, чем используется для CISS-гибридизации с хромосомоспецифичными ДНК-пробами. В этих условиях различия в числе копий одинаковых последовательностей ДНК приводили к воспроизводимым различиям в интенсивности сигнала, регистрируемого после гибридизации.

В настоящее время для получения ДНК-проб используется преимущественно DOP-PCR и другие системы полногеномной амплификации ДНК. Это позволяет получить ДНК-пробы из небольшой группы клеток, изолированных лазерной диссекцией (при необходимости из одной клетки) [3, 8]. Т.е., на старте в распоряжении исследователя есть лишь несколько десятков пикограмм ДНК (при анализе индивидуальных клеток около 7 пикограмм). В этом случае, основным механизмом формирования различий в интенсивности сигнала при разной копийности хромосом или хромосомных районов является получение ДНК-проб, имеющих в своем составе различную представленность их последовательностей ДНК. При использовании таких ДНК-проб возможно некоторое увеличение количества меченой ДНК при проведении FISH.

123