ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ

Сила воли ведет к действию, а позитивные действия формируют позитивное отношение

Как определить диапазон голоса - ваш вокал

Игровые автоматы с быстрым выводом

Как цель узнает о ваших желаниях прежде, чем вы начнете действовать. Как компании прогнозируют привычки и манипулируют ими

Целительная привычка

Как самому избавиться от обидчивости

Противоречивые взгляды на качества, присущие мужчинам

Тренинг уверенности в себе

Вкуснейший "Салат из свеклы с чесноком"

Натюрморт и его изобразительные возможности

Применение, как принимать мумие? Мумие для волос, лица, при переломах, при кровотечении и т.д.

Как научиться брать на себя ответственность

Зачем нужны границы в отношениях с детьми?

Световозвращающие элементы на детской одежде

Как победить свой возраст? Восемь уникальных способов, которые помогут достичь долголетия

Как слышать голос Бога

Классификация ожирения по ИМТ (ВОЗ)

Глава 3. Завет мужчины с женщиной

Оси и плоскости тела человека - Тело человека состоит из определенных топографических частей и участков, в которых расположены органы, мышцы, сосуды, нервы и т.д.

Отёска стен и прирубка косяков - Когда на доме не достаёт окон и дверей, красивое высокое крыльцо ещё только в воображении, приходится подниматься с улицы в дом по трапу.

Дифференциальные уравнения второго порядка (модель рынка с прогнозируемыми ценами) - В простых моделях рынка спрос и предложение обычно полагают зависящими только от текущей цены на товар.

Определением изоферментов.

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

В МЕДИЦИНЕ

Для студентов лечебного и педиатрического факультетов НГМУ

Новосибирск 2011

УДК 615.355:615.166(072)

ББК 28.072+35.66я73

П-75

Вохминцева Л.В.

Применение ферментов в медицине. - Новосибирск, 2011.- 40с.

В настоящем учебном пособии представлены основы медицинской энзимологии. Рассмотрены принципы энзимодиагностики, причины изменения активности ферментов в сыворотке крови, пути повышения специфичности энзимологических исследований. В пособие включены правила определения активности ферментов в биологических средах. Изложены основные направления использования ферментов, а именно, применение ферментов в качестве лекарственных препаратов (заместительная терапия, удаление некротирующих тканей, фибринолитические средства и др.) и аналитических реагентов.

Учебное пособие может быть использовано при подготовке студентов к практическим и лабораторным занятиям по курсу биологической химии, а также коллоквиумам и экзамену. Пособие предназначено для студентов 2 курса лечебного, педиатрического факультетов.

Рецензенты:

О.Н. Потеряева, д.м.н., профессор кафедры общей и биоорганической химии

Е.Н. Самсонова, д.м.н., профессор кафедры патофизиологии с курсом клинической патофизиологии.

Утверждено и рекомендовано к печати ЦМК фармакологического факультета НГМУ (протокол №_ от _________ 2011 г.)

ПРЕДИСЛОВИЕ

Настоящее учебное пособие разработано в соответствии с Федеральными государственными образовательными стандартами высшего профессионального образования по направлению подготовки (специальностей) «Лечебное дело» (060101) и «Педиатрия» (060103), утвержденными 8 ноября 2010 г. а также рабочими программами по биологической химии, на основании которых ведётся подготовка специалистов в ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете по специальностям «Лечебное дело» и «Педиатрия».

Учебной пособие предназначено для самостоятельной подготовки к практическим занятиям по биохимии для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов по теме «Ферменты».

Пособие состоит из нескольких частей. Первая часть включает вопросы использования определения активности ферментов в биологических жидкостях с целью диагностики заболеваний. Освящены основные причины изменения активности ферментов в сыворотке крови, представлены недостатки энзимологических исследований и пути их преодоления.

Во второй части пособия представлены основные направления использования ферментов в качестве лекарственных средств. Уделено внимание преимуществам и недостаткам иммобилизованных ферментов. В раздел включены основные причины ограничения применения ферментных препаратов.

Применение ферментов в качестве аналитических реагентов отражено в третьей части пособия. Рассмотрены примеры использования ферментов в технологии «сухой химии», иммобилизованные ферменты как рабочие части ферментных электродов и автоматических анализаторов, иммуноферментный анализ.

Для контроля самоподготовки студентов в приложении 1. представлены задания в тестовой форме.

Для углубления представлений об использования ферментов в биохимических методах исследования и в качестве аналитических реагентов, ферментных препаратов можно использовать интернет-ресурсы и литературу, представленные в конце пособия.

ВВЕДЕНИЕ

Биологическая химия (от греч. bios – жизнь) – наука о химическом строении и функциях веществ, входящих в состав живой материи и их превращениях в процессах жизнедеятельности. Совокупность этих превращений в постоянной взаимосвязи с окружающей средой обеспечивает функционирование живых организмов в условиях сбалансированности процессов синтеза и распада веществ в клетках и тканях.

Инструментами химических превращений в клетке являются ферменты, которые представляют собой биологические катализаторы белковой природы. Всё многообразие биохимических реакций, протекающих в организме человека, катализируется соответствующими ферментами. В отличие от неорганических катализаторов ферменты имеют свои особенности. Во-первых, скорость ферментативного катализа на несколько порядков выше, чем скорость небиологического катализа. Во-вторых, действие каждого фермента высокоспецифично, т.е. каждый фермент действует только на свой субстрат или группу родственных субстратов, тогда как неорганические катализаторы ускоряют различные реакции. В-третьих, ферменты катализируют химические реакции в мягких условиях, т.е. при обычном давлении, невысокой температуре (20-50 °С) и при значениях рН среды, в большинстве случаев, близких к нейтральному.

Учение о ферментах – энзимология является важнейшей и стремительно развивающейся областью биохимии. Большие достижения в области химии и биохимии ферментов, развитии методов их выделения и очистки, разработка простых способов определения их активности позволили использовать ферменты в медицине, биотехнологии. Ферменты являются важным инструментом в изучении механизмов обмена веществ, в расшифровке структуры химических соединений.

В настоящее время можно выделить основные направления медицинской энзимологии – энзимодиагностику, энзимотерапию, использование ферментов в качестве аналитических реагентов,которым посвященыосновные разделы учебного пособия.

1. ЭНЗИМОДИАГНОСТИКА

Одним из направлений медицинской энзимологии является энзимодиагностика – исследование ферментов в биологических средах организма с диагностической целью. Измерение активности ферментов играет важ­ную роль в диагностике и лечении целого ряда заболеваний. Активность ферментов измеряют не только при наследственных дефектах ферментов, но и при большинстве заболеваний. Изменение концентрации (активнос­ти) фермента является скорее следствием, чем причиной патологического процесса.

Для трактовки результатов необходимо знать:

- относится ли данный фермент к функциональным (секреторным) или нефункциональным (экскреторным или внутриклеточным) ферментам;

- внутриклеточную локализацию фермента (мембранный, цитоплазматический, митохондриальный);

- скорость синтеза фермента, скорость высвобождения из клеток и удаления из внеклеточной жидкости путём инактивации, разрушения и экскреции;

- наличие в биологическом материале активаторов и ингибиторов этого фермента;

- наличие фармакологической и ятрогенной интерференции.

Для энзимодиагностики, определения активности ферментов используют наиболее часто плазму [1]или сыворотку[2] крови. Кроме крови, для энзимодиагностики можно также использовать и мочу. Гораздо реже, в основном в специализированных клиниках, используют также лимфу, спинно-мозговую жидкость, синовиальную жид­кость, бронхолаважную жидкость, экссудаты из плевральной и брюшной полости. Кроме того, определить активность ферментов можно в тканях: биоптатах, форменных элементах крови. Наиболее часто в медицинской практике используют сыворотку или плазму крови.

1.1. Функциональные и нефункциональные ферменты и причины изменения их активности

Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы (табл.1). Первая, относительно небольшая группа ферментов активно секретируется в плазму крови определёнными органами. В крови человека эти ферменты, проферменты и их субстраты в норме циркулируют и выполняют физиологические функции. Эта группа ферментов называется функциональными ферментами(илисекреторными ферментами). Основным источником функциональных ферментов является печень. К ним относятся, например, липопротеинлипаза, сывороточная холинэстераза, проферменты систем свёртывания, фибринолиза и комплемента (табл. 1). Ренин крови синтезируется в почках. Концентрация функциональных ферментов в крови такая же, как в тканях (печени), или более высокая.

Изменение активности функциональных (секреторных) ферментов при патологии обычно заключается в понижении их активности в сыворотке или плазме крови. Причинами уменьшения активности (как правило, вследствие снижения количества ферментов) являются уменьшение числа клеток, секретирующих фермент (снижение активности сывороточной холинэстеразы при циррозе печени или снижение пепсиногена при гастроэктомии), избирательная недостаточность синтеза ферментов вследствие наследственных дефектов (уменьшение церулоплазмина при болезни Вильсона-Коновалова), наличие ингибиторов в крови, нарушение функциональной активности органа при патологии (в первую очередь нарушается белоксинтезирующая функция печени при гепатитах), а также недостаточность аминокислот, витаминов или микроэлементов, необходимых для синтеза ферментов.

Таблица 1

Ферменты крови

Однако большинство ферментов сыворотки крови являются нефункциональными ферментами(табл.1), т.е. не выполняют известных физиологических функций, их субстраты в сыворотке не обнаруживаются. Эти ферменты работают в клетках тканей и органов (внутриклеточные ферменты) и не имеют физиологического значения в плазме крови. К внутриклеточным ферментам относят аланинаминотрансферазу, аспартатаминотрансферазу, креатинкиназу, лактатдегидрогеназу, щелочную фосфатазу, g-глутамилтрансферазу и др.

Кроме того, к нефункциональным относят также ферменты, секретируемые экзокринными железами (экскреторные ферменты). Примерами экскреторных ферментов являются пепсин, трипсин, a-амилаза, липаза. Небольшие количества внутриклеточных и экскреторных фер­ментов присутствуют в крови как результат нормального клеточного обновления. У здорового человека низкая активность нефункциональных ферментов (внутриклеточных и экскреторных) в плазме поддерживается на определённом уровне, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток при апоптозе и скоростей разрушения и выведения из кровотока.

Основной причиной повышения активности нефункциональных ферментов в крови является повреждение структуры клеток. При нарушении проницаемости мембраны клеток (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе) освобождается большое количество ферментов, и их концентрация в крови растёт.

Таблица 2

Внутриклеточная локализация ферментов

Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов (Табл.2). Так, появление в плазме крови ферментов, имеющих цитозольную (гистидаза, аланинаминотрансфераза, лактатдегидрогеназа) или мембранную локализацию (щелочная фосфатаза, g-глутамилтрансфераза), свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении ферментов митохондрий (аспартатаминотрансфераза, глутаматдегидрогеназа) или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например о некрозе.

Повышение концентрации не всегда отражает повреждение ткани. Возможны другие причины:

· усиленное обновление клеток;

· клеточная пролиферация (например, опухоли);

· усиленный синтез ферментов (индукция ферментов);

· обструкция при секреции (закупорка желчных путей);

· сниженный клиренс[3] при ряде заболеваний почек.

Причинами снижения уровня нефункциональных ферментов крови являются нарушение белкового синтеза в органе (накопление тетрациклина – ингибитора синтеза белка в печени), недостаточность аминокислот (голодание или белковая недостаточность), дефицит витаминов, необходимых для синтеза коферментов (активная форма витамина В₆ - кофермент аминотрансфераз) или уменьшение числа клеток (замещение паренхиматозных клеток органа соединительной тканью при циррозе).

На уровень активности сывороточных ферментов также влияет скорость удаления их из сосудистого русла. Относительные молекулярные массы большинства внутриклеточных ферментов больше 65000, поэтому экскреция их с мочой не может играть существенной роли в удалении ферментов из крови. Молекулы некоторых ферментов, например, a-амилазы, (относительная молекулярная масса 45000), могут пройти через нормальные клубочки и экскретироваться с мочой.

Разрушение сывороточных ферментов происходит при участии протеиназ крови. В дальнейшем в выведении ферментов из сосудистого русла участвует ретикуло-эндотелиальная система.

В табл.3 представлены данные о времени циркуляции ряда ферментов в плазме крови.

Таблица 3

Период «полужизни» некоторых ферментов в плазме крови

(Комаров Ф.И. с соавт., 1999)

На представленном выше рисунке (рис.1) суммированы основные причины изменения активности сывороточных ферментов.

Рис.1. Факторы, влияющие на уровень ферментов в сыворотке (Цыганенко А.Я. с соавт., 2002).

Таким образом, энзимодиагностика основана на следующих принципах:

· при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

· количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

· активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;

· ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

· существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

1.2. Повышение специфичности энзимологических исследований

Основным недостатком использования фермен­тов в диагностике повреждения тканей является отсутствие специфичности по отношению к конк­ретной ткани или типу клеток. Многие ферменты присутствуют в разных тканях, и повышение фер­ментной активности в плазме может быть следствием повреждения любой из этих тканей.

Повышение специфичности энзимологических исследований достигается тремя путями:

1. интерпретацией результатов исследований в свете клинической картины;

2. выполнением набора тестов;

определением изоферментов.

Необходимость интерпретации данных исследований активности ферментов обусловлена широкой распространённостью ферментов в организме. Например, аминотрансферазы присутствуют в любой клетке организма и повреждение любого органа приведёт к увеличению концентрации этих ферментов в плазме крови. Активность аспартатаминотрансферазы может повышаться при инфаркте миокарда, гепатите, гемолитических анемиях. Однако различия в клинической картине позволяют врачу установить источник повышения активности фермента в сыворотке.

Биохимические исследования редко выполняются изолированно и выполнение набора тестов может помочь в дифференциальной диагностике заболеваний. Различные ткани могут содержать (и поэтому освобождать при повреждении) два или большее число ферментов в разных соотношениях. Например, несмотря на отсутствие органной специфичности, определение активности АЛТ и АСТ при заболеваниях печени и сердца имеет большую диагностическую ценность. АЛТ и АСТ присутствуют во всех тканях и органах, но в разных количествах (табл.4). В кардиомиоцитах аспартатаминотрансфераза преобладает (по сравнению в аланинаминотрансферазой), поэтому при повреждении клеток сердца (инфаркт миокарда) в плазме крови активность АСТ будет выше, чем АЛТ. Коэффициент де Ритиса (отношение активности АСТ к АЛТ) при инфаркте миокарда резко возрастает. В норме коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) равен 1,33±0,42.

При повреждении клеток печени (например, при гепатитах) в сыворотке крови преобладает АЛТ, по сравнению с АСТ, так как относительное содержание аланинаминотрансферазы выше в гепатоцитах. Коэффициент де Ритиса в этом случае £1. При некрозе гепатоцитов в кровь высвобождается большое количество митохондриальной АСТ и коэффициент де Ритиса становится, наоборот, ³1.

Таблица 4

Распределение ферментов в некоторых тканях человека

(Комаров Ф.И. с соавт., 1999)

Активность щелочной фосфатазы увеличивается при холестазе (нарушение оттока желчи по желчевыводящим путям) и заболеваниях костной ткани. При холестазе часто увеличивается и уровень билирубина, и также активность других внутриклеточных ферментов (аминотрансфераз), тогда как при заболеваниях костной ткани этого не происходит. Подтвердить источник повышения щелочной фосфатазы биохимическим способом можно с помощью определения активности g-глутамилтрансферазы, высокая активность которой выявляется при холестазе. При заболеваниях костной ткани уровень активности этого фермента находиться в пределах нормы.

1.3. Множественные формы ферментов.

Некоторые ферменты существуют в различных формах, катализирующих одну и ту же реакцию с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента. Индивидуальные формы ферментов часто являются характеристикой опре­деленной ткани и, имея сходную каталитическую активность, часто отличаются по первичной структуре белковой молекулы, и, соответственно, по физико-химическим свойствам, которые можно измерить (напри­мер, по термостабильности, чувствительности к ингибиторам или разности в заряде белковых молекул изоферментов). На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов (электрофорез, хроматография).

Впервые номенклатура множественных форм ферментов предложена Международным биохимическим союзом в 1964 году. Используемые в настоящее время рекомендации по номенклатуре, охватывающие все множественные формы ферментов, были приняты в 1971 году. В соответствии с рекомендациями Международного биохимического союза термин «множественные формы ферментов» необходимо применять как широкий термин для обозначения всех белков, катализирующих одну и ту же реакцию. Термин «изоферменты» (isoenzyme" или "isozyme") следует применять только к тем множественным формам ферментов, которые имеют генетически обусловленные различия в первичной структуре и не являются модификацией данной первичной структуры. Классы множественных форм ферментов представлены в табл.5.

Таблица 5

Множественные формы ферментов

(Рекомендации UPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature

CBN, 1976 )

Примечание: * - Данный класс входит в категорию изоферментов.

В отечественной литературе к изоферментам помимо генетически независимых белков и аллоферментов относят гетерополимеры (гибриды), а также мутантные формы ферментов, образующиеся в результате мутации гена.

Лактатдегидрогеназа

Фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты). Лактатдегидрогеназапредставляет собой олигомерный белок с молекулярной массой 134 000 Д, состоящий из 4 субъединиц двух типов: М (от англ., muscle - мышца) и Н (от англ., heart – сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования 5 изоферментов лактатдегидрогеназы:

Несмотря на то, что по общему количеству ЛДГ разные органы и ткани мало отличают­ся друг от друга, изоферментный состав ЛДГ в разных тканях будет различаться довольно значительно (Рис.6). В тканях с преимущественно аэробным обменом веществ (сердце, мозг, почки) наибольшей активностью обладают ЛДГ₁ и ЛДГ₂. В тканях с выраженным анаэробным обменом (печень, скелетные мышцы) преобладают ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Однако существуют и исключения – в эритроцитах, тромбоцитах и клетках хрусталика, несмотря на выраженный анаэробный обмен, наибольшую активность имеют фракции ЛДГ₁ и ЛДГ₂.

Таблица 6

Относительная активность изоферментов лактатдегидрогеназы

в различных тканях (Сарири Р., Гафури Х., 2008)

Следовательно, при наличии каких-либо патологических изменений, например, при повреждениях некротического характера, в крови будет увеличиваться та мо­лекулярная форма, которая характерна для данного органа. Так, например, при инфаркте миокарда в крови повышается активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂, а при остром гепатите - ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Изоформы ЛДГ отличаются электрофоретической подвижностью, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоферментов ЛДГ. Повышение общей активности фермента наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь одной из перечисленных тканей. Для постановки диагноза необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза.

Креатинкиназа

Креатинкиназа катализирует реакцию образования креатинфосфата из АТФ и креатина. Молекула креатинкиназы (КК) представляет собой димер, состоящий из субъединиц двух типов: М (от англ, muscle - мышца) и В (от англ, brain - мозг). Из этих субъединиц образуются 3 изофермента – КК-ВВ, КК-MB, КК-MM.

Изофермент КК-ВВ находится преимущественно в головном мозге, КК-ММ - в скелетных мышцах и КК-MB – в сердечной мышце (табл. 7).

Изоформы креатинкиназы имеют разную электрофоретическую подвижность. Определение активности фермента в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изофермента). Количество изофермента КК-ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц.

Таблица 7

Общая и изоферментная активность креатинкиназы (КК) в некоторых тканях человека

Изофермент КК-ВВ не может проникать через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

1.4. Единицы активности ферментов

В противоположность большинству других биохимических компонентов количество фермента не может быть измерено, за некоторым исключением, в единицах массы. О количестве фермента косвенно судят по его активности, т.е. по производимому ферментом действию. Таким образом, присутствие и количество фермента распознаётся по специфичности и скорости катализируемой им реакции.

Каталитическую активность ферментов выражают в единицах активности. Наиболее часто используют международные единицы активности.

Международная единица активности(МЕ, U, Е, Ед) – это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата или получение 1 мкмоля продукта в минуту в стандартных оптимальных условиях.

Единица активности в системе СИ – катал (кат.). Она соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата или получение 1 моля продукта в секунду.

1 кат. = 6 • 107 МЕ.

1 МЕ = 16, 67 • 10–9 кат.

В медицине концентрацию ферментов в биологических жидкостях принято выражать в единицах активности на литр (МЕ/л, кат./л).

1.5. Правила определения активности ферментов

в сыворотке крови

Важное значение для воспроизводимости и точности результатов имеет стандартизация и оптимизация условий тестирования, т.е. при проведении исследований необходимо строго соблюдать одни и те же условия. Например, создание оптимальных рН и температуры для проведения ферментативной реакции, использование буфера точной концентрации и вида.

Для того, чтобы скорость реакции зависела только от концентрации фермента, при постановке ферментативной реакции необходимо определять активность фермента в самом начале реакции в условиях достаточного насыщения его субстратом (субстрат должен быть в избытке). В этом случае концентрация продуктов реакции недостаточна для того, чтобы началась обратная реакция.

При выборе материала исследования необходимо учитывать также наличие исследуемых ферментов в клетках крови и возможность их освобождения при гемолизе, что исказит результаты исследования.

Таблица 8

Уменьшение активности ферментов в сыворотке при хранении

(Тимин О.А. с соавт., 2002)

Для большинства ферментов не имеет значения, определяется ли их активность в плазме или сыворотке крови, но это имеет значение для тех ферментов, которые содержатся в тромбоцитах (кислая фосфатаза, лактатдегидрогеназа), так как при активации свёртывании крови эти ферменты будут освобождаться из тромбоцитов и ферментативная активность в сыворотке крови будет выше, чем в плазме.

При разведении биологической жидкости активность фермента изменяется не всегда пропорционально, вследствие нарушения естественной среды фермента и соотношения активаторов и ингибиторов.

Активность фермента следует определять в свежем биологическом материале, так при хранении активность многих ферментов снижается (табл.8).

При постановке ферментативных проб необходимо также помнить, что многие лекарственные вещества могут оказывать влияние на активность ферментов. Например, результаты исследования активности ЛДГ завышают кодеин, клофибрат. Эритромицин, метилдофа, индометацин завышают результаты исследования АЛТ. Применение изониазида, эритромицина, тетрациклина, парацетамола завышают показатели активности АСТ. Аспирин занижает результаты исследования активности аминотрансфераз.

1.6. Биохимические констелляции

(спектры биохимических тестов)

Определение активности ферментов в биологических жидкостях в настоящее время является обязательным компонентом диагностики заболеваний органов и тканей. Одним из способов рационализации применения лабораторных исследований и повышения специфичности энзимодиагностики является использование констелляций, или спектров (наборов) биохимических тестов. Назначение исследований является прерогативой клинициста.

Инфаркт миокарда

Разрушение клеток при инфаркте миокарда сопровождается повышением содержания бирмаркеров некроза в крови, к которым относят активность внутриклеточных ферментов кардиомиоцитов креатинкиназы, изофермента креатинкиназы КК-МВ (см. табл.7), аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и ее изоферментов, а также белки кардиоспецифические тропонин Т (сТnT) и тропонин I (cТnTI) миоглобин, сердечный белок, связывающий жирные кислоты (h-FABP – heart fatty acid-binding protein).

Динамика активности ферментов, имеющих диагностическую ценность при инфаркте миокарда представлена в табл.9.

Таблица 9

Временные интервалы диагностической значимости исследования активности ферментов сыворотки крови при остром инфаркте миокарда

Динамика изменения креатинкиназы КК-МВ, а также других маркеров некроза для ранней диагностики представлена на рис. 2.

Рис. 2. Время выхода миоглобина, КК-МВ, сTnI и сTnT (Christenson R. H., Azzazy H. M. E. Biomarkers of necrosis:
past, present and future. // Morrow D. A., ed. Cardiovascular Biomarkers: Pathophysiology and Clinical Management. — N. Y. : Humana Press, 2006).

Повреждения нервной ткани

При закрытой черепно-мозговой травме исследование активности ферментов церебро-спинальной жидкости позволяет уточнить тяжесть травматического повреждения мозга и прогноз заболевания. Закономерно при травме мозга возрастает активность АСТ, ЛДГ, КК. Общая активность ЛДГ в церебро-спинальной жидкости при тяжёлых травмах превышает нормальные величины в 10-18 раз, КК – в 20-30 раз и более. Соотношение активности ЛДГ в венозной крови и ликвора является прогностическим критерием исхода травмы. Если это соотношение более 7, то исход благоприятен, менее 1 – прогноз плохой. Активность КК-ВВ и ЛДГ_1-2 в ликворе коррелирует с тяжестью травматического повреждения мозга. Присоединение воспалительных осложнений вызывает увеличение доли ЛДГ_4-5.

Панкреатит

Лабораторная диагностика заболеваний поджелудочной железы основана на определение ферментативной активности амилазы и её изоферментов, липазы в крови и моче. Повышение активности ферментов при остром панкреатите (повреждение панкреацитов последующей ферментативная аутоагрессия и разрушением клеток) начинается через 3-6 часов, максимальное повышение активности наблюдается через 20-30 часов. Острый панкреатит также сопровождается повышением активности трипсина в сыворотке крови.

Для диагностики хронического воспаления поджелудочной железы используют определение активности в сыворотке крови a-амилазы и ее изоферменты, липазы, трипсина, аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, g-глутамилтрансферазы, в сыворотке и определение активности a-амилазы в моче.

Гепатит

В качестве индикатора повреждения гепатоцитов (синдром цитолиза) используют определение активности внутриклеточных ферментов АЛТ, АСТ, ГГТ, глутаматдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, сорбитолдегидрогеназа, альдолаза, активность которых в сыворотке крови повышается (Рис.3).

Также наблюдается умеренное увеличение активности (в 3 раза выше нормы) других внутриклеточных ферментов щелочная фосфатазы и g-глутамилтрансферазы. При нарушении оттока желчи (холестатический синдром) активность этих ферментов повышается в большей степени (в 5-10 раз выше норма), что связано в увеличением синтеза щелочной фосфатазы и g-глутамилтрансферазы в клетках биллиарных канальцев и соллюбилизацией ферментов с последующим высвобождением их в сосудистое русло. Для оценки наличия холестатического синдрома кроме определения активности щелочной фосфатазы и g-глутамилтрансферазы в сыворотке крови оценивают активность лейцинаминопептидазы, 5-нуклеотидазы, активность которых при нарушении оттока желчи в сыворотке крови увеличивается.

Рис. 3. Динамика активности ферментов при остром вирусном гепатите. На абсциссе показаны недели после появления желтухи, на ординате – активность ферментов (Назаренко Г.И., Кишкун А.А. 2000).

Костная ткань

В качестве биохимического маркера формирования костной ткани используют определение в сыворотке активности щелочной фосфатазы (костного изофермента). Биохимическим маркером разрушения (рассасывания) кости является тартрат-резистентная кислая фосфатаза, которую определяют в сыворотке крови.

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Современная медицина все шире использует ферментыв качестве перспективных средств медикаментозного лечения вследствие их исключительно высокой активности и специфичности.

Имеют место следующие направления применения ферментов в медицине:

· заместительная терапия (устранение дефицита ферментов с целью компенсации врожденной или приобретенной функциональной недостаточности);

· удаление нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых фрагментов;

· лечение келлоидных рубцов;

· лизис тромбов;

· противовирусная терапия;

· комплексная терапия злокачественных новообразований;

· системная энзимотерапия.

2.1. Заместительная терапия

Жизнедеятельность каждого организма обеспечивается множеством химических реакций, катализируемых ферментами. Нарушение деятельности ферментов (ферментопатии или энзимопатии) лежат в основе практически любого заболевания. В зависимости от причин выделяют несколько видов энзимопатий. Прежде всего – это наследственные энзимопатии, в основе которых лежит наследственный дефект синтеза фермента. Эти заболевания передаются по наследству и сопровождают больного в течение всей его жизни. В настоящее время выявлено около 1500 наследственных энзимопатий. Например, классическая фенилкетонурия (нарушение синтеза фенилаланингидроксилазы, катализирующей превращение фенилаланина в тирозин) или болезнь Гоше (недостаточность лизосомального фермента глюкоцереброзидазы).

Другой причиной нарушения синтеза ферментов может быть недостаточность витаминов (активные формы которых являются коферментами) – алиментарная энзимопатия. Недостаточность в пище тиамина (витамин В₁) приведёт к нарушению энергетического обмена и снижению выработки АТФ вследствие снижения активности пируватдегидрогеназного и a-кетоглутаратдегидрогеназного мультиферментных комплексов.

Кроме того, любое заболевание приводит к нарушению функционирования клеток того или иного органа, сопровождающегося снижением синтеза ферментов. Например, воспаление поджелудочной железы сопровождается снижением синтеза и секреции пищеварительных ферментов – липазы, трипсина, химотрипсина, a-амилазы. Воспаление в слизистой желудка приведёт к снижению синтеза и секреции пепсина.

В настоящее время с целью заместительной терапии наиболее широко применяются гидролитические ферменты. Пищеварительные ферменты, участвующие в переваривании белков (трипсин, химотрипсин), углеводов (a-амилаза), жиров (липаза), и их препараты широко применяются в качестве средств заместительной терапии при недостаточности секреции желудочных и кишечных желёз, поджелудочной железы. Гидролитические ферменты получают из слизистой оболочки желудка (абомин), поджелудочной железы крупно-рогатого скота (мезим форте, дигестал, панкреатин), грибов Penicillium solitum (солизим), Aspergillus oryzae (ораза) или растений – семян чернушки дамасской и лютиковых (нигедаза), экстракта куркумы (панкурмен).

В качестве заместительной терапии при нарушении функциональной активности желудочно-кишечного тракта применяют комбинированные препараты, имеющие в своём составе несколько ферментов, которые гидролизуют белки, жиры и углеводы. К таким препаратам относятся: панзиформ форте (пепсин, амилаза, липаза, протеазы, катепсин, экстракт желчи), креон (амилаза, липаза, протеазы), мезим форте (амилаза, липаза, протеазы), фестал (липаза, амилаза, протеазы, гемицеллюлаза, компоненты желчи), дигестал (амилаза, липаза, протеазы, экстракт желчи, гемицеллюлаза).

Растительные липолитические ферменты (препарат нигедаза), растворимы в кишечнике, что обеспечивает полное сохранение активности при нормальной или повышенной кислотности желудочного сока и частично (примерно наполовину) – при сниженной кислотности желудочного сока. Амилолитические и протеолитические ферменты грибов (препарат ораза), также не разрушаются в желудочном соке, сохраняя ферментативные активности в кишечнике.

Другая область применения заместительной терапии – это лечение заболеваний, связанных с наследственными энзимопатиями. Это заболевания врожденные, при которых нарушен синтез каких-либо ферментов. Эти патологии обычно чрезвычайно тяжелые, дети с наследственным отсутствием какого-либо фермента живут недолго, страдают тяжелыми умственными и расстройствами, отсталостью физического и умственного развития. Заместительная терапия иногда может по­мочь преодолеть эти нарушения. Однако существуют значительные трудности, связанные с доставкой фермента в клетки и органеллы - к месту его работы. Эти трудности успешно преодолены в лечении болезни Гоше, в основе развития которой лежит наследственная недостаточность лизосомального фермента b-глюкоцереброзидазы (катализирует гидролиз глюкоцереброзида до глюкозы и церамида и предупреждает его накопление в макрофагах). Так как макрофаги являются клетками, способными к фагоцитозу, то рекомбинантная макрофагнацеленная b-глюкоцереброзидаза (имиглуцераза, церезим) попадает в клетки и лизосомы путём эндоцитоза. Для лечении наследственного заболевания – болезни Фабри используется a-галактозидаза, недостаточность данного лизосомального фермента лежит в основе этого заболевания. В результате сниженного синтеза a-галактозидазы нарушается катаболизм гликолипидов в лизосомах.

2.2.Удаление некротирующих тканей

В хирургической, стоматологической практике широко используются ферменты с целью удаления нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых фрагментов. В этих случаях применяют гидролитические ферменты, в основном протеиназы такие, как трипсин, химотрипсин и др.

Трипсинпредставляет собой фермент, разрывающий пептидные связи в молекуле белка. Расщепляет также высокомолекулярные продукты распада белков, полипептиды типа пептонов, а также некоторые низкомолекулярные пептиды, содержащие определенные аминокислоты (аргинин, лизин). Фермент активен при рН 5,0 - 8,0 с оптимумом активности при рН 7,0. Для применения в медицинской практике трипсин получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота.

Применение трипсина в медицинской практике основано на его способности, расщеплять при местном воздействии некротизированные ткани и фибринозные образования, разжижать вязкие секреты, экссудаты, сгустки крови. Энзиматический лизис является методом избиратель­ного удаления нежизнеспособных тканей. Такое направленное действие протеиназ объясняется тем, что в живых тканях на­ходятся специфические и неспецифические ингибиторы, тормозящие действие протеолитических фер­ментов. В связи с этим высокоочищенные кристаллические препараты протеиназ используются как эффективные противовоспалительные средства. Таким образом, по отношению к здоровым тканям фермент неактивен и безопасен.

Трипсин применяют как вспомогательное средство для облегчения удаления вязких секретов и экссудатов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей (трахеиты, бронхиты, бронхоэктатическая болезнь, пневмонии и др.). В этих случаях препарат применяют для ингаляции (в виде аэрозоля) и внутримышечно. Препарат можно вводить и внутриплеврально. Трипсин вызывает разжижение мокроты и облегчает ее выделение. После ингаляций необходимо обеспечить возможно более полное удаление мокроты (откашливанием или отсасыванием).

Для лечения ожогов, пролежней, гнойных ран трипсин применяют местно. Для этого разработаны специальные лекарственные формы трипсина, иммобилизованного на специальных полимерных основах (полотне).

Химотрипсин также является протеолитическим ферментом, получаемым из поджелудочной железы убойного скота. В соке поджелудочной железы содержится в неактивном состоянии в виде химотрепсиногена (химотрипсиноген А и В), который активируется под влиянием трипсина, причем из химотрипсиногена А образуется ряд форм: a-, b-, g-, s- и p-химотрипсины, а из химотрипсиногена В - химотрипсин В. Все формы химотрипсина близки по ферментативным свойствам, но отличаются активностью. Практическое значение в качестве лекарственного средства в настоящее время имеет a-химотрипсин, который выпускается под названием "химотрипсин кристаллический".

Подобно трипсину гидролизует белки и пептоны с образованием относительно низкомолекулярных пептидов. От трипсина отличается тем, что расщепляет преимущественно связи, образованные остатками ароматических аминокислот (тирозин, триптофан, фенилаланин, метионин). В некоторых случаях химотрипсин производит более глубокий гидролиз белка, чем трипсин. Отличается от трипсина также тем, что вызывает свертывание молока. Более стоек, чем трипсин, и медленнее инактивируется.

Применение химотрипсина (как и трипсина) в медицинской практике основано на специфической способности расщеплять при местном воздействии некротизированные ткани и фибринозные образования, разжижать вязкие секреты и экссудаты, а при внутримышечном введении оказывать противовоспалительное действие.

Коллагеназа – является ещё одним протеолитическим ферментов животного происхождения, который применяется в медицинской практике. Ферментный препарат получают из поджелудочной железы убойного скота. Коллагеназа обладает протеолитической активностью; влияя преимущественно на коллагеновые волокна, способствует расплавлению струпов и некротических тканей. Применяют местно для ускорения отторжения струпов и некротизированных тканей после ожогов и отморожений; при трофических язвах для очищения от гнойно-некротических налетов.

В медицинской практике используют растительные протеолитические ферменты, получаемые из млечного сока дынного дерева, или папайи - папин, химопапаин А и В, пептидазы А и В. К препаратам, содержащим растительные протеолитические ферменты относят карпазин и лекозим (содержит также лизоцим – муколитический фермент). Карипазин расщепляет некротизированные ткани, разжижает вязкий секрет, экссудат, его применяют при ожогах для ускорения отторжения струпьев и для очищения гранулирующих ран от гнойно-некротических масс. В отличие от карипазина, лекозим применяют не только местно, но и парентерально. Лекозим нашел применение в ортопедической и травматологической практике (при остеохондрозе позвоночника, посттравматических контрактурах, для санации свищей и др.); в нейрохирургической практике (патология позвоночника, рубцово-спаечные изменения после травмы периферических нервов и др.); в офтальмологической практике (для рассасывания экссудатов, при помутнениях роговицы, помутнении стекловидного тела и др.). Применяют лекозим в виде инъекций, глазных капель, методом электрофореза.

Нашли своё применение и бактериальные протеолитические ферменты, которые характеризуются поразительно широкой специфичностью или даже полным отсутствием какой бы то ни было специфичности. Некоторые бактериальные протеазы расщепляют около 80% всех пептидных связей в белках. Широко используют в медицине щелочные протеиназы Bac. Subtilis – субтилизины, поскольку они гидролизуют белки глубже и с большей скоростью, чем многие другие протеиназы, в том числе и животного происхождения. Иммобилизация ферментов на аминоцеллюлозе (препарат профезим) обеспечивает пролонгированность действия. Субтилизины обладает способностью гидролизовать денатурированные белки, оказывая некролитический эффект.

Кроме бактериальных протеиназ в медицинской практике используются протеолитические ферменты грибов, также обладающие широкой специфичностью. Террилитин – препарат протеолитического действия, являющийся продуктом жизнедеятельности плесневого гриба Аspergillus terriсоlа. Также применяют модифицированную форму лекарственную форму террилитина, получаемую путем присоединения террилитина к полиглюкину (препарат терридеказа). Применяют наружно для лечения гнойных ран, пролежней, трофических язв.

В состав лекарственных препаратов входят также гидролитические ферменты нуклеазы, разрушающие ДНК и РНК. Дезоксирибонуклеаза гидролизует (деполимеризует) ДНК с образованием дезоксирибонуклеотидов. Для медицинского применения получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Дезоксирибонуклеаза используют для лечения гнойно-некротических процессов, вызванных, в основном, вирусами, так как фермент вызывает деполимеризацию и разжижение гноя. Применяют при воспалительных заболеваниях, вызванных вирусами (вирус герпеса, аденовирус) для уменьшения вязкости и улучшения эвакуации гноя.

Рибонуклеаза обладает специфической способностью деполимеризовать РНК до кислоторастворимых моно- и олигонуклеотидов. Ферментный препарат также получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Препарат способен разжижать гной, слизь, вязкую и густую мокроту. Основные показания к применению рибонуклеазы такие же, как для трипсина кристаллического.

2.3. Применение ферментов в лечении келлоидных рубцов

В медицинской практике успешно применяют гликозидазы, к которым относится гиалуронидаза (специфический субстрат – гиалуроновая кислота). Гиалуроновая кислота является мукополисахаридом, в состав которого входят ацетилглюкозамин и глюкуроновая кислота. Гиалуроновая кислота обладает высокой вязкостью. Её биологическое значение заключается главным образом в том, что она является цементирующим веществом соединительной ткани. Гиалуронидаза вызывает распад гиалуроновой кислоты и, тем самым, уменьшает её вязкость. В результате повышается проницаемость тканей и облегчается движение жидкостей в межтканевых пространствах. Гиалуронидаза содержится в разных тканях организма. Соотношением «гиаулороновая кислота – гиалуронидаза» в значительной степени регулируется проницаемость тканей. Действие фермента носит обратимый характер. При уменьшении её концентрации вязкость гиалуроновой кислоты восстанавливается. Таким образом, гиалуронидаза может применяться для временного уменьшения вязкости гиалуроновой кислоты.

Противовоспалительное действие различных лекарственных средств (салицилатов, производных пиразолона, глюкокортикоидов, стероидов и др.) частично связано с их способностью уменьшать активность гиалуронидазы. Наоборот, действие некоторых веществ, вызывающих повышение проницаемости (например, пчелиного и змеиного яда), связано отчасти с наличием в них гиалуронидазы.

Фермент гиалуронидазу получают из семенников крупного рогатого скота. Гиалуронидаза входит в состав таких препаратов, как лидаза и ронидаза, которые применяют в качестве келлоидолитических препаратов с целью увеличения проницаемости капилляров, рассасывания рубцовой ткани.

Коллагеназа избирательно действующая на коллаген (основной компонент соединительной ткани), вызывает его деструкцию. Ферментный препарат, содержащий коллагеназу (Коллализин^®) оказывает литический эффект на келлоидную ткань.

2.4. Фибринолитические средства

Фибринолитические препараты вызывают разрушение образовавшихся нитей фибрина; они способствуют, в основном, рассасыванию свежих (ещё не подвергшихся ретракции) тромбов. В качестве фибринолитических средств применяют протеолитические ферменты. Препараты делят на две группы – прямого и непрямого действия. К первой группе относят вещества, непосредственно влияющие на плазму крови, сгусток нитей фибрина. К ним относят плазмин – фермент, который образуется при активации, содержащегося в крови плазминогена. Ко второй группе относят активаторы плазминогена: бактериальную стрептокиназу и рекомбинантной тканевый активатор плазминогена – алтеплазу. Они неактивны при непосредственном действии на нити фибрина, но при введении в организм активируют эндогенную фиброинолитическую систему крови (превращают плазминоген в плазмин, тем самым, способствуя растворению фибринового сгустка). Основное применение в качестве фибринолитических средств в настоящее время имеют препараты, относящиеся к непрямым фибринолитикам.

С большим успехом используется стрептокиназа, полученная из культуры различных штаммов Streptococcus haemolyticus. Фермент, взаимодействуя с плазминогеном, образует «активаторный комплекс», катализирующий превращение плазминогена крови и кровяных сгустков в плазмин. Последний обладает протеолитической активностью, вызывает лизис нитей фибрина кровяных сгустков, деградацию фибриногена и других плазменных протеинов (в том числе V и VII факторов свёртывания крови), растворяет тромбы, действуя как на их поверхности, так и изнутри. Стрептокиназа наиболее эффективна при свежих сгустках фибрина (до ретракции). Иммобилизованная стрептокиназа (стрептодеказа) оказывает пролонгированное фибринолитическое действие. Фибринолитические препараты используют при лечении тромбозов конечностей, коронарных сосудов, легких и других заболеваниях сосудов.

2.5. Ферменты как противовирусные препараты

В состав лекарственных препаратов входят также гидролитические ферменты нуклеазы, разрушающие ДНК и РНК. Дезоксирибонуклеаза гидролизует (деполимеризует) ДНК с образованием дезоксирибонуклеотидов. Для медицинского применения получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота.

Дезоксирибонуклеазу применяют в качестве антивирусного препарата. Фермент обладает способностью задерживать развитие вирусов герпеса, аденовирусов и других вирусов, содержащих ДНК. Эффект связан с деполимеризацией ДНК до моно- и олигонуклеотидов путем расщепления межнуклеотидных связей. Подавляя синтез вирусной ДНК, дезоксирибонуклеаза не повреждает вместе с тем ДНК клеток макроорганизма.

Кроме того, дезоксирибонуклеаза используют для лечения гнойно-некротических процессов, вызванных, в основном, вирусами. Препарат вызывает также деполимеризацию и разжижение гноя. Применяют при герпетических кератитах, аденовирусных конъюнктивитах и кератитах, абсцессах легких, остром катаральном воспалении верхних дыхательных путей аденовирусной природы; для уменьшения вязкости и улучшения эвакуации мокроты и гноя при бронхоэктатической болезни, пневмонии, у больных с гнойными заболеваниями легких, туберкулезом легких.

Рибонуклеаза обладает специфической способностью деполимеризовать РНК до кислоторастворимых моно- и олигонуклеотидов. Ферментный препарат также получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Фермент способен разжижать гной, слизь, вязкую и густую мокроту; имеет также противовоспалительные свойства. В связи с разрушением нуклеиновых кислот, рибонуклеаза обладает способностью задерживать размножение ряда РНК-содержащих вирусов.

Основные показания к применению рибонуклеазы такие же, как для трипсина кристаллического. Кроме того, препарат применяют (внутримышечно) при лечении клещевого энцефалита.

2.6. Применение ферментов в комплексной противоопухолевой терапии

Особое значение занимает энзимотерапия опухолевых заболеваний. В течение многих лет в качестве комплексной терапии некоторых форм лейкозов применяют фермент L-аспарагиназу (аспарагиназа медак).

Предпосылкой антилейкемического действия аспарагиназы послужило обнаружение в лейкозных клетках дефектного фермента аспарагинсинтетазы, катализирующего реакцию синтеза аспарагина. Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если имеющийся в плазме аспарагин разрушать введением аспарагиназы, то в лейкозных клетках наступит дефицит аспарагина и в результате - нарушение метаболизма клетки. В первую очередь снижение синтеза белка наблюдается в быстро-делящихся лейкозных клетках. Тем самым значительно уменьшается число опухолевых клеток в периферической крови и костном мозге.

Применение ферментных препаратов (при парентеральном введении) ограничено их иммуногенностью и крайне малым временем нахождения в организме человека. В этом отношении гораздо более перспективно применение иммобилизованных ферментов, которые более стабильны, обладают пролонгированным действием, меньшей иммуногенностью. В препарате онкаспар L-аспарагиназа путём химического метода иммобилизации фермент образует ковалентные связи с носителем – монометоксиполиэтиленгликолем.

2.7. Системная энзимотерапия

Одним из современных направлений использования ферментов в качестве лекарственных средств является системная энзимотерапия – лечение с помощью целенаправленно составленных смесей гидролитических ферментов, лечебная эффективность которых основана на комплексном воздействии на ключевые процессы, происходящие в организме. В состав препаратов (вобэнзим, флогэнзим и вобэ-мугос Е) входят ферменты растительного и животного происхождения. Ферменты оказывают противовоспалительное, иммуномодулирующее, антиагрегатное, фибринолитическое, противоотечное, вторичноанальгезирующее действие. Однако остаются открытыми вопросы, связанные с пониманием механизмов фармакологического действия, а также с возможностью резорбции перорально применяемых ферментов из кишечника в кровь.

2.8. Иммобилизованные ферменты и преимущества их применения

Сочетание уникальных каталитических свойств ферментов с преимуществом иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать лекарственные препараты пролонгированного действия.

Под иммобилизацией понимают закрепление агента на некотором носителе путем химических (ковалентных) или физико-химических связей. В качестве носителей для иммобилизованных агентов могут использоваться различные вещества: природные и синтетические, органические и неорганические, высоко- и низкомолекулярные.

Наиболее широко в качестве природных носителей используются полисахариды, также как целлюлоза, декстан, агароза и их производные. Синтетические полимерные носители для иммобилизации ферментов созданы на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиуретана.

В качестве низкомолекулярных носителей применяются либо природные липиды (в основном фосфолипиды), либо их синтетические аналоги. Липидные носители используются в виде монослоёв на различных поверхностях или в виде бислоёв сферической формы (липосомы). Липосомы нашли широкое применение в косметологии, а также в составе препаратов для внутреннего применения.

Неорганические носители – это матрицы на основе силикагеля, глины, керамики, природных минералов и их оксидов.

В настоящее время в медицине в качестве носителей применяются целлюлоза, акриламид, активированный уголь, декстран, силикагель, глина, алюмогель и др.

Существуют две основные группы методов иммобилизации ферментов на носителе:

· физическиеметоды, не предполагающие связывания фермента с носителем ковалентными связями;

· химические, при использовании которых между ферментом и носителем образуются ковалентные связи.

Самым старым способом иммобилизации является физическая абсорбция (Рис.4). В основе этого способа – физическое или ионное взаимодействие фермента с носителем, который может быть как неорганическим, так и органическим веществом. Недостаток такого метода иммобилизации является десорбция и её последствия. Для уменьшения десорбции иммобилизацию проводят: а) на носителе, модифицированным обработкой ионами металлов, различными функциональными группами, ковалентной пришивкой молекул, являющихся специфическими лигандами для иммобилизованных веществ; б) с агентом, до иммобилизации модифицированным введением ионогенных или гидрофобных групп; в) и использованием бифункциональных носителей.

Недостатки адсорбции можно избежать при иммобилизации ферментов в поры геля (Рис.4). Для иммобилизации ферментов применяются: несшитые полимерные гели, образующиеся полисахаридами (крахмалом, агар-агаром, альгинатом, каррагинаном и др.); сшитые полимерные гели, образуемые поливиниловым спиртом или полиакриламидные гели. Преимущества ферментов, включенных в матрицу заключаются в том, что фермент практически не прикреплён и, следовательно, не испытывает стерических помех, активный центр фермента не блокирован, фермент защищен от действия протеаз.

Рис. 4. Методы иммобилизации ферментов. а – адсорбция фермента на носителе; б – метод включения фермента в гель; в – ковалентное связывание фермента с носителем; г – включение фермента в полупроницаемые капсулы. 1 – носитель; 2 – молекулы фермента.

При использовании химических методов иммобилизации (Рис.4) ковалентные связи образуются за счёт содержания на поверхности фермента различных функциональных групп: гидроксильных, имидазольных, карбоксильных, тиоловых, аминогрупп и др. В некоторых случаях процесс иммобилизации протекает с участием третьего участника – сшивающего агента. Ковалентная иммобилизация позволяет получать препараты с з