ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ

Оси и плоскости тела человека - Тело человека состоит из определенных топографических частей и участков, в которых расположены органы, мышцы, сосуды, нервы и т.д.

Отёска стен и прирубка косяков - Когда на доме не достаёт окон и дверей, красивое высокое крыльцо ещё только в воображении, приходится подниматься с улицы в дом по трапу.

Дифференциальные уравнения второго порядка (модель рынка с прогнозируемыми ценами) - В простых моделях рынка спрос и предложение обычно полагают зависящими только от текущей цены на товар.

Т-лимфоциты и их характеристика

Т-лимфоциты в процессе дифференцировки в тимусе приобретают различные рецепторы:

Т-клеточный – TCR, CD3, CD4, CD8 и другие.

Созревшие в тимусе наивные Т-лимфоциты мигрируют в Т-зоны периферических лимфоидных органов.

Основное предназначение Т-лимфоцитов:не способны распознавать свободный антиген.

- распознавание поверхностных структур собственных клеток организма,

- формирование иммунного ответа на «измененное свое».

При этом АПК представляют антигены (АГ) на своей мембране в комплексе с МНС I/II: АГ+МНС I/II. Происходит двойное распознавание этого комплекса Т-лимфоцитами (МНС-рестрикция Т-лимфоцитов)

Благодаря расшифровке молекулярной структуры рецепторов мембраны Т-лимфоцитов, зрелые наивные неиммунные Т-лимфоциты, выходящие из тимуса представлены основными субпопуляциями, которые несут разную функциональную нагрузку:

1. СD8+-лимфоциты выполняют функции цитотокси-ческих лимфоцитов (ЦТЛ), Это Т-киллеры или «перфорин-гранзимовые киллеры». Они «своим телом» непосредственно убивают клетки-мишени. Взаимодействуют с молекулами МНС I класса.

2. CD4+ -лимфоциты – Т-хелперы. Они в процессе развития иммунного ответа на антиген дифференцируются в Т-клетки памяти.

Th2-лимфоциты – дифференцированная субпопуляция Т4-лимфоцитов, продуци-руют ИЛ-4 и ИЛ-13, взаимодействуют с В-л и определяют образование IgE, активируют аллергопроцесс.

Tfh – взаимодействуют с В2 (классическими лимфоцитами) для формирования гуморального адаптивного иммунитета (выработка Ig M, G, F), формирование памяти. CD4 Tfh-клетки (T-follicular helper) выполняют хелперную функцию в отношении В-клеток и служат одной из наиболее многочисленных и важных субпопуляций эффек-торных Т-клеток во вторичных лимфоидных тканях. Tfh – это представители класса эффекторных Th, которые принимают участие в развитии антиген-специфического В-лимфоцит-опосредованного иммунного ответа. Основные отличительные признаки Tfh-клеток — экспрессия рецептора хемокинов CXCR5 (лиганд CXCL13) и молекул ICOS, миграция и локализация в В-клеточных фолликулах, осуществление помощи В-клеткам. Tfh-лимфоциты вырабатывают «хелперный» цитокин ИЛ-21, стимули-рующий развитие В-клеток в антителопродуценты (плазмоциты). Дефицит продук-ции IL-21 или IL21-рецептора нарушает переключение изотипа АТ и формирование центр размножения (ГЦ). В отличие от других субпопуляций Т-клеток, Tfh продуци-руют небольшое количество цитокинов, наиболее важным из которых является IL-21 и IL-4.

Th9-лимфоциты – функционально близки к Th2, аллергопатология. Th9 клетки имеют важное значение для иммунной защиты против паразитарных инфекций (гельминтов), но также могут содействовать развитию хронического аллергического воспаления, ремоделированию дыхательных путей и аутоиммунным заболеваниям.

Th22 – Этот термин относится к части Т-хелперов, которые характеризуются секрецией IL22 и TNF-альфа , а не гамма-интерферона , ИЛ-4, или IL17 (Eyerich и др., 2009). Эти клетки проникают в эпидермис у пациентов с воспалительными расстройствами кожи. Th22 клетки экспрессируют белки, участвующие в реконструкции тканей , такие как факторы роста фибробластов , а также хемокины участвующие в ангиогенезе и фиброзе. Участвуют в развитии псориаза

Th17 – взаимодействуют с нейтрофилами, привлекая их в очаг. Недавно обнаружена отдельная линия эффекторных Т-хелперов, селективно вырабатывающих ИЛ-17. Они участвуют в регуляции воспаления и аутоиммунных реакций. Клетки получили название Тh17-лимфоцитов.

Кроме того, Т-лимфоциты в тимусе могут дифференцироваться в естественные регуляторные Т-клетки (Treg), экспрессирующие поверхностные маркеры CD4+, CD25+ и транскрипционный фактор FOXP3. Эти клетки способны подавлять иммунный ответ, опосредуемый Тh1- и Тh2-клетками путем прямого межклеточного контакта и синтеза ТФР-р и ИЛ-10. Основной характеристикой Трег-клеток является способность продуцировать ИЛ-10 и трансформирующий фактор роста β (TGF-β). Трег-клетки угнетают аллергениндуцированную активацию специфических Т-клеток. Они также супрессируют такие эффекторные клетки аллергического воспаления, как тучные клетки, базофилы и эозинофилы, и снижают уровень продукции IgЕ. Примечательно, что цитокины ИЛ-10 и TGF-β, продуцируемые Трег-клетками, индуцируют синтез иммуноглобулинов IgG- и IgА-изотипов. Известно, что эти иммуноглобулины не вызывают аллергический иммунный ответ. Сегодня описано несколько субпопуляций Трег-клеток, отличающихся различными фенотипами и регуляторными эффектами. Среди них выделяют естественно встречающиеся CD4+CD25+Foxp3+-Трег-клетки, прошедшие селекцию в тимусе, и индуцибельные ИЛ-10 – секретирующие Трег-клетки 1 типа. Трег-клетки могут непосредственно ингибировать эффекторные клетки аллергического воспаления. Они прямо угнетают дегрануляцию тучных клеток, вызванную через FcεRI, путем контакта ОХ40 – ОХ40L.

Т-клетки памяти (англ. memory cells) — долгоживущие лимфоциты, примированные антигеном, но не достигшие стадии терминальной дифференцировки в клетки-эффекторы. Т-клетки памяти экспрессируют молекулы CD45RO (изоформа тирозинфосфатазы) и много молекул CD44, способствующих их активной рециркуляции. При повторном контакте с тем же антигеном они отвечают намного быстрее и активнее, чем наивные лимфоциты. Клетки памяти отличаются от наивных большим сроком жизни, выраженной рециркуляцией и способностью к самоподдержанию

В лимфатических узлах содержится основное количество Т-лимфоцитов (41,2%). Среди них CD4+ Т-клетки составляют 46,9%, CD8' Т-лимфоциты — 35,0%. В селезенке содержится 15,2% лимфоцитов от общего количества в организме. На долю Т-хелперов приходится 6,9%, на долю ЦТЛ — 19,4%.

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается в 1) использовании системы гидрофокуссировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке; 2) облучении клетки лазерным излучением; 3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Принцип метода:

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями к определенным рецептрам, по которым необходимо вести анализ клеток, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

· рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

· рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).

· интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Иммунология

· иммунофенотипирование клеток периферической крови

· определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)

· определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)

· определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов

· определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)

· исследование клеточного цикла

· оценка клеточной цитотоксичности

Онкология

· количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)

· анализ стадий клеточного цикла

· выявление анеуплоидного клона

· определение пролиферативной активности анеуплоидного клона

· определение специфических маркеров

· позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска

· оценка состояния иммунной системы:

· оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)

· оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.)

Цитология

· определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток

· оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов

· определение экспрессии поверхностных антигенов

· анализ стадий клеточного цикла

· измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca²⁺, потенциал наружной клеточной мембраны)

Гематология

· анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови

· подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам

· дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов

· диагностика лимфопролиферативных заболеваний

· диагностика острых лейкозов

· оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология

· измерение экспрессии маркеров

· измерение активности внутриклеточных ферментов

· определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

ПРАКТИКУМ ПО ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

Иммунофенотипирование лимфоцитов крови человека

Термин “лимфоциты” объединяет незернистые лейкоциты крови (агранулоциты), образующиеся из единого предшественника (лимфобласта), развивающиеся в лимфоидной ткани и циркулирующие в крови и лимфе. Выделяют три основных типа лимфоцитов: Т-клетки (Т-лимфоциты), В-клетки (В-лимфоциты) и NK-клетки (естественные киллеры). В совокупности они составляют 25–30% всех лейкоцитов (1500–2200 в 1 мм3крови).

Различение типов лимфоцитов осуществляется на основании анализа фенотипа – набора белков (маркеров), экспрессируемых на поверхности клетки и участвующих в выполнении функций, специфических для каждой субпопуляции лимфоцитов.

С целью систематизации известных поверхностных молекул лейкоцитов введена номенклатура CD (от англ. “cluster of differentiation” – кластер дифференцировки), в соответствии с которой каждой молекуле, независимо от ее химической структуры, присвоен определенный номер. Наличие молекулы на поверхности обозначается как “+”, отсутствие “–”. Некоторые CD молекулы, используемые для идентификации основных групп лимфоцитов, приведены:

- CD45 – тирозиновая протеинфосфатаза, участвующая в работе сигнальных путей клетки;

- CD3 – белок-корецептор антиген-распознающего Т-клеточного рецептора;

- CD4 – трансмембранный гликопротеин, участвующий в распознавании молекул антигена, связанных с антиген-презентирующим комплексом II класса. Данный белок, кроме Т-лимфоцитов, экспрессируется на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках и т.д.;

- CD8 – трансмембранный гликопротеин, участвующий в распознавании молекул антигена, связанных с антиген-презентирующим комплексом I класса;

- CD19 – белок в составе корецепторного комплекса антиген-распознающего В-клеточного рецептора. Присутствует на B-лимфоцитах с самых ранних этапов развития и теряется на этапе их созревания в плазматические клетки;

- CD56 – гликопротеин, участвующий в клеточной адгезии и экспрессирующийся на поверхности нейронов, глиальных клеток, клеток скелетной мускулатуры и NK-клеток;

- CD16 – рецептор для Fc-фрагмента иммуноглобулинов G, присутствующий на поверхности части NK-клеток, полиморфноядерных нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и макрофагов.

CD молекулы, используемые для идентификации основных групп лимфоцитов

Группа CD маркеры

Лейкоциты CD45+

Т-лимфоциты CD45+, CD3+

Т-хелперы CD45+, CD3+, CD4+

Т-киллеры CD45+, CD3+, CD8+

В-лимфоциты CD45+, CD3-, CD19+

NK-клетки CD45+, CD3-, CD56+, CD16+/-

Так как большинство CD присутствуют на нескольких типах клеток, определение только одного CD не позволяет точно определить тип клетки. Для точной идентификации типа клетки необходимо определение сочетания, или комбинации, маркеров.

Для определения фенотипа клеток используется метод иммунофенотипирования: клетки окрашиваются специфичными к CD антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями. Связывание маркированных антител с клеткой определяется тем, какие именно CD она экспрессирует. После такой окраски проводится анализ флуоресценции клеток с помощью проточной цитофлуориметрии.