ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ

Оси и плоскости тела человека - Тело человека состоит из определенных топографических частей и участков, в которых расположены органы, мышцы, сосуды, нервы и т.д.

Отёска стен и прирубка косяков - Когда на доме не достаёт окон и дверей, красивое высокое крыльцо ещё только в воображении, приходится подниматься с улицы в дом по трапу.

Дифференциальные уравнения второго порядка (модель рынка с прогнозируемыми ценами) - В простых моделях рынка спрос и предложение обычно полагают зависящими только от текущей цены на товар.

Провести облік ІФА, що була поставлена з метою виявлення НВsAg у сироватці крові хворих з підозрою на вірусний гепатит В (демонстраційна робота).

Практичне заняття № 11

Тема: «Серологічні реакції з мітками»

План

1. Ознайомлення із принципами проведення реакції лізису.

2. Ознайомлення із методикою підготовки інгрідієнтів, проведення основного досліду реакції звязування комплементу (РЗК).

3. Ознайомлення із принципами проведення реакцій імунофлуоресценції (РІФ), імуноферментного аналізу (ІФА), ланцюгової полімеразної реакції (ЛПР).

Актуальність теми:

На сучасному етапі розвитку мікробіології та імунології серед імунологічних методів діагностики інфекційних захворювань все ширше застосовуються серологічні реакції з міченими антигенами або антитілами, такі як реакція імунної флуоресценції (РІФ), імуноферментний (ІФА) та радіоімунний аналізи (РІА). Це зумовлено високою чутливістю та специфічністю вказаних реакцій, можливістю застосування їх з метою експрес-діагностики інфекційних захворювань.

Застосування серологічних реакцій з метою серодіагностики інфекційного захворювання та з метою сероідентифікації збудників, що виділені від хворого, є необхідним для встановлення заключного діагнозу інфекційного захворювання. На занятті студентам надається можливість оволодіти методикою постановки основних серологічних реакцій (реакція аглютинації, реакція пасивної гемаглютинації, реакція гемолізу). Розуміння ролі антитілоутворення у формуванні імунної відповіді є необхідним підгрунтям для формування уявлення про складний механізм функціонування імунної системи та її ролі у розвитку імунозалежних патологій. Вміння обирати потрібні для діагностики інфекційного захворювання серологічні реакції, ставити їх та інтерпретувати отримані результати є важливим для формування у студентів клінічного мислення і розуміння суті патологічного процесу при інфекційних хворобах.

Все це зумовлює актуальність теми заняття та спрямоване на формування позитивної мотивації її вивчення.

Рекомендації для оформлення протоколу.

Проведення обліку реакції Відаля, що поставлена з метою визначення АТ в сироватці крові хворого проти збудників черевного тифу та паратифів А і В.

При обліку реакції Відаля враховують, з яким з діагностикумів та в якому титрі відбулась реакція аглютинації. При позитивній реакції аглютинації утворюється білуватий осад на дні пробірки з більш-менш прозорою рідиною над ним. При негативній реакції рідина залишається каламутною, осад на дні пробірки відсутній. Діагностичним титром реакції Відаля у хворих, що не вакцинувались та мають типову клінічну картину, вважається 1:100, а при атипових чи стертих клінічних формах захворювання – не нижче 1:200.

Постановка реакції зв’язування комплементу (РЗК) з метою виявлення антитіл в досліджуваній сироватці.

Реакція зв’язування комплементу заснована на здатності специфічного комплексу антиген+антитіло адсорбувати (зв’язувати) комплемент. Оскільки процес зв’язування комплементу не проявляється візуально, то як індикатор використовується гемолітична система (еритроцити барана + гемолітична сироватка), яка свідчить про наслідки реакції між антигеном і антитілом. Якщо антиген і антитіло відповідають один одному, то комплемент зв’язується цим комплексом і гемоліз не проходить, а якщо комплекс не утворюється, то наступає гемоліз.

РЗК відноситься до складних серологічних реакцій і для її здійснення необхідно не менше 5 інгредієнтів: антиген, антитіло і комплемент (перша система), еритроцити барана і відповідна їм гемолітична сироватка.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ДОСЛІДУ РЕКЦІЇ ЗВ’ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РЗК) З МЕТОЮ ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ В ДОСЛІДЖУВАНІЙ СИРОВАТЦІ

№ пробірок Інгредієнти (в мл)	Дослідна	Контрольні

Досліджувана сироватка (1:10)	0,5	---	0,5	0,5	---	---
Антиген в робочій дозі	0,5	0,5	---	0,5	0,5	0,5
Комплемент в робочій дозі	0,5	0,5	0,5	---	0,5	0,5
Сироватка завідомо позитивна (1:10)	---	---	---	---	0,5	---
Сироватка завідомо негативна (1:10)	---	---	---	---	---	0,5
Ізотонічний розчин NaCl	---	0,5	0,5	0,5	---	---
В термостат на 2 години при 37⁰
Гемолітична система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
В термостат на 1 годину при 37⁰

Провести ідентифікацію культури грибів роду Candida, що забарвлені імунною сироваткою, міченою флуорохромом, в препараті за допомогою реакції імунофлуоресценції (РІФ) (демонстраційна робота). Зробити висновок.

При постановці прямої РІФ досліджуваний матеріал (культури грибів роду Candida) бактеріологічною петлею наносять на знежирене предметне скло, готують тонкий мазок, висушують його на повітрі, фіксують. На зафіксований препарат наносять 1-2 краплі флуоресціюючої сироватки і фарбують його у вологій камері 20-30 хв. при 25⁰ С. Після інкубації препарат промивають 2-4 рази забуференим ізотонічним розчином, впродовж 10-15 хв. прополіскують дистильованою водою, висушують, наносять краплю нефлуоресціюючої олії і розглядають в люмінесцентному мікроскопі за допомогою імерсійного об’єктиву. При цьому гриби роду Candida дають яскраве світіння на темному фоні.

Провести облік ІФА, що була поставлена з метою виявлення НВsAg у сироватці крові хворих з підозрою на вірусний гепатит В (демонстраційна робота).

Наявність і активність ферменту, зв’язаного з антитілом чи комплексом антиген-антитіло виявляють і оцінюють візуально за інтенсивністю забарвлення після інкубації з відповідним субстратом.

Питання для самоконтролю.

· На якому принципі заснована реакція зв’язування комплементу; в чому її переваги перед іншими серологічними реакціями?

· Які серологічні реакції можна застосувати з метою експрес-діагностики інфекційних захворювань?

· Які перспективи і аспекти використання моноклональних антитіл? Чому в серологічних реакціях з мітками віддається перевага саме моноклональним антитілам?

· В чому полягають принципи прямої та непрямої РІФ, ІФА, РІА, які переваги та недоліки цих методів?

Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення

Реакція зв’язування комплементу	Реакцією зв’язування комплементу – багатокомпонентна серологічна реакція, що полягає у взаємодії антигену з відповідним специфічним антитілом з утворенням специфічного комплексу антиген-антитіло та
	зв’язуванням комплементу. Утворений комплекс не викликає ніяких зовнішніх змін того середовища, в якому він утворився. Щоб встановити, чи відбулось зв’язування комплементу чи він лишився вільним (незв’язаним), в реакцію вводять другу систему (гемолітичну), яка в свою чергу складається з антигену (3% завис еритроцитів) та специфічної гемолітичної сироватки (взятої в потроєному титрі). За відсутності вільного активного комплементу гемолізу еритроцитів під дією специфічних гемолізинів не відбувається (реакція позитивна). У випадку невідповідності антитіла та антигену в першій системі, комплемент лишається вільним та в його присутності настає гемоліз другої системи (реакція негативна).
Моноклональні антитіла	Моноклональні антитіла (МКАТ) – антитіла, що отримують за допомогою гібридомних технологій. Належать до одного класу імуноглобулінів і реагують зі специфічним епітопом антигену, проти якого вони продуковані. В серологічних реакціях з міткою використання антитіл має цілу низку переваг у порівнянні з поліклональними антитілами, а саме: висока гомогенність, відсутність неспецифічних антитіл, простота розпізнавання і відсутність варіативності від партії до партії зразків.
Серологічні реакції з мітками	Серологічні реакції з міткою засновані на виявленні взаємодії антигену з антитілом з утворенням імунного комплексу антиген-антитіло за міткою одного з учасників реакцій, що виявляється або візуально, або за допомогою спеціальних високочутливих приладів, що дозволяють кількісно виявити мічений субстрат і, відповідно, невідомий антиген чи антитіло.
Мітка	В якості мітки застосовують або флуоресціюючий в ультрафіолетовому світлі барвник (ізоционат флюоресцеїну) при постановці реакції імунофлуоресценції (РІФ), або фермент (пероксидаза, лужна фосфатаза), що виявляється за зміною забарвлення відповідного субстрату при постановці імуноферментного аналізу (ІФА), або ізотоп, що виявляється радіометрією при постановці радіоімунного аналізу (РІА).

Реакція імунофлюоресценції	Реакція імунофлюоресценції (РІФ) заснована на властивості флюоресціюючих антитіл специфічно з’єднуватись з гомологічним антигеном і викликати їх світіння в фіолетовій і ультрафіолетовій частині спектру люмінесцентного мікроскопу. РІФ специфічна, високочутлива, використовується в основному для ідентифікації антигену і може бути здійснена в кількох варіантах. 1. Пряма РІФ – заснована на використанні імунофлуоресціюючих сироваток проти кожного досліджуваного антигену. 2. Непряма РІФ – заснована на використанні двох різних сироваток. Спочатку на першому етапі вживають немічені антитіла проти досліджуваного антигену, а на другому етапі реакції утворений комплекс антиген-антитіло обробляють флуоресціюючою сироваткою, що містить антитіла проти гамма-глобулінів того виду тварин, на яких була одержана специфічна немічена сироватка.
Імуноферментний аналіз	Імуноферментний аналіз (ІФА) заснований на використанні як мітки антитіл ферментів, здатних розкладати субстрати з утворенням забарвлених продуктів. Використовуються як прямий, так і непрямий варіанти ІФА. Суть її полягає в тому, що спочатку на якомусь твердому матеріалі сорбують антигени (або антитіла), а потім додають всі інші інгредієнти серологічної реакції. Як твердофазні носії антигену чи антитіл широко використовуються пластикові планшети, шарики, плівки, пробірки з різних синтетичних матеріалів. Адсорбовані на поверхні таких матеріалів антигени чи антитіла навіть у висушеному стані довгий час зберігають свою імунологічну специфічність і здатність вступати в серологічні реакції. Наявність і активність ферменту, зв’язаного з антитілом чи комплексом антиген-антитіло виявляють і оцінюють візуально за інтенсивністю забарвлення після інкубації з відповідним субстратом. ІФА може бути виконаний за допомогою спеціального обладнання, в якому автоматично відбувається промивка реагентів буфером (вошер) та результат реєструється за допомогою фотометра (рідер).

Радіоімунний аналіз	Радіоімунний аналіз (РІА) заснований на використанні як мітки одного з компонентів серологічної реакції радіоактивних ізотопів. Метод найбільш чутливий і дозволяє виявляти незначні кількості реагентів. Як і при постановці ІФА використовують прямий і непрямий варіанти. Для проведення РІА і реєстрації результатів необхідна спеціальна радіометрична апаратура.

Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент на занятті:

Термін	Визначення

Серологічна реакція	Реакція специфічної взаємодії антигенів (Аг) та антитіл (Ат).

Реакція аглютинації	Аглютинація являєсобою процес склеювання корпускулярних антигенів (бактерії, еритроцити) при дії на них специфічних антитіл у присутності електроліту з утворенням аглютинату. Аглютинація – це спосіб виявлення та кількісного визначення Аг або Ат, заснований на їх здатності до формування видимих конгломератів.
Реакція преципітації	Преципітація – це осадження дрібно-дисперсного або розчинного молекулярного Аг під впливом специфічної сироватки.
Серологічна ідентифікація	Серологічна ідентифікація – це визначення (ідентифікація) невідомого Аг за допомогою відомих Ат з використанням серологічних реакцій.
Імунна діагностична сироватка	Імунна діагностична сироватка (ІДС) – це стандартний препарат, що містить Ат до певної групи мікробів і використовується для постановки серологічної реакції.

Термін	Визначення

Реакції лізису	Реакцією лізису називають розчинення антигену під дією антитіла у присутності комплементу. Свіжевиділена з організму людини імунна сироватка здатна до лізису, бо містить антитіла та комплемент. Якщо ж сироватка прогрівалась чи довго зберігалась, то лізис відбувається лише за умови додавання комплементу.
Реакція імунного гемолізу	Реакція імунного гемолізу базується на тому, що при імунізації тварин (частіше кролів еритроцитами барана) в сироватці крові з’являються специфічні захисні антитіла – гемолізини, які здатні в присутності комплементу порушувати зв’язок гемоглобіну зі стромою еритроцитів та викликати гемоліз (вихід гемоглобіну назовні еритроцита). Імунна сироватка, яка містить гемолізини, має назву гемолітичної сироватки. Такі сироватки випускають Інститути бактеріальних препаратів.
Сила гемолітичної сироватки	Сила гемолітичної сироватки визначається в титрах – це максимальне її розведення в об’ємі 0,5 мл, при якому спостерігається повний гемоліз 0,5 мл 3% зависі баранячих еритроцитів у присутності 0,5 мл комплементу, розведеного 1:10 та витримуванні пробірок впродовж години при 37⁰ С.
Реакція непрямої гемаглютинації	Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) полягає в тому, що еритроцити барана чи іншого виду тварин, маючи здатність адсорбувати на собі антигени, стають “чутливими” (сенсибілізованими) до відповідної імуної сироватки. Під впливом специфічних антитіл сенсибілізовані еритроцити склеюються та випадають в осад, утворюючи на дні пробірки (або лунки) гемаглютинат. Відрізняючись високою специфічністю та чутливістю, РНГА дозволяє виявляти мінімальну кількість антитіл.
Система комплементу	Група сироваткових білків, які в процесі їх активації перетворюються в ефекторні молекули, що призводять до розвитку запалення (С3а, С5а, С4а), фагоцитозу (С3b)та руйнуванню клітин (С6-9). Таким чином, білки комплементу приймають участь у розвитку запальних реакцій, реакцій опсонізації та лізису клітинних мембран.

Діагностикуми	Діагностикуми – стандартні антигени, в ролі яких можуть бути суспензії інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному розчині. Діагностикуми застосовуються при серологічній діагностиці інфекційних захворювань.