 ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ
| Эмиссионный и абсорбционный спектральный анализ, его медицинское применение.
Спектры поглощения и испускания вещества являются источником информации о качественном составе (из каких молекул или атомов состоит вещество), количественном соотношении различных компонентов вещества, их состоянии и структурной организации. В спектральном анализе используют как спектры испускания (эмиссионный спектральный анализ), так и спектры поглощения (абсорбционный спектральный анализ). В зависимости от энергии (частоты) фотона, испускаемого или поглощаемого атомом (или молекулой), классифицируют следующие виды спектроскопии: радио-, ИК, УФ, видимого излучения, рентгеновская. По типу вещества источника спектра различают атомные, молекулярные спектры и спектры кристаллов. В медицинских целях эмиссионный анализ служит в основном для определения микроэлементов в тканях организма, небольшого количества атомов металлов в консервированных продуктах с гигиенической целью, некоторых элементов в трупных тканях для целей судебной медицины и так далее. Абсорбционные спектры широко используются в современных биохимических и биофизических работах. Различают качественный (определение состава вещества) и количественный (определение концентраций соединений, входящих в данное вещество) спектральный анализ. Имеется три основных формы гемоглобина: дезоксигемоглобин (степень окисления иона железа 2+, нет лиганда), оксигемоглобин (степень окисления иона железа 2+, лиганд - молекула кислорода), метгемоглобин (степень окисления иона железа 3+, лигандом является молекула воды). Каждая из форм гемоглобина характеризуется своим спектром поглощения (рис. 5.) Таким образом, в рассматриваемом нами образце гемоглобина, как мы можем заключить качественно, присутствуют оксигемоглобин (полосы поглощения 541 и 577 нм) и метгемоглобин полосы поглощения 500 и 630 нм).
Рис. 5. Спектры электронного поглощения оксигемоглобина (1), дезоксигемоглобина (2), метгемоглобина (3). Фосфатный буфер; рН 7.
Для количественных оценок необходимо знать величины экстинкций (e) форм гемоглобина на определенных длинах волн. Величина экстинкции равна поглощению (оптической плотности) определенного вещества, взятого в концентрации 1 моль (при l=1см). Учитывая, что оптическая плотность разбавленных растворов гемоглобина определяется формулой:
где с – концентрация гемоглобина в молях, e - экстинкция форм гемоглобина в (моль.см)-1, l- длина кюветы в см (обычно l =1 см). Измерив оптическую плотность на двух длинах волн (577 и 500 нм), легко найти концентрации форм гемоглобина (сmet и coxy), решив систему двух уравнений:
В рассматриваемом случае (см. рис. 4): D577=0.650, D500=0.310, e577, oxy=15.370 л.мМ-1.см-1, e577,met=4.1 л.мМ-1.см-1, e500, oxy=5.05 л.мМ-1.см-1, e500,met=9.04 л.мМ-1.см-1. Подставляя величины в систему уравнений, получаем величины концентрации форм гемоглобина: сoxy=4,2.10-5 М, cmet=1,08.10-5 М. Подобным образом рассчитывают концентрации форм гемоглобина в крови пациентов в клинике. Ряд фотометрических методов по определению концентрации вещества в окрашенном растворе (концентрационная колориметрия) разработан на основе закона Бугера-Ламберта-Бера В этих методах измеряют световые потоки, прошедшие через раствор, коэффициент пропускания или оптическую плотность. Нижние границы концентраций, определяемых с помощью колориметров, в зависимости от рода вещества составляют 10-3 ¸ 10-8 моль/л. Приборы, используемые в концентрационной колориметрии, имеют общее название - колориметры; их подразделяют на субъективные (визуальные) и объективные (фотоэлектроколориметрические). ФЭК используют в клинической практике, в частности, для измерения насыщения крови кислородом, то есть для определения количества оксигемоглобина. Соответствующие приборы называют оксигемометрами или оксигемографами.
Рассеяние света Рассеянием светаназывают явление, при котором распространяющийся в среде световой пучок отклоняется по всевозможным направлениям. Необходимое условие для возникновения рассеяния света — наличие оптических неоднородностей, т. е., в частности, областей с иным, чем основная среда, показателем преломления. Рассеяние света возникает на оптических неоднородностях среды. Различают два основных вида таких неоднородностей: 1) мелкие инородные частицы в однородном прозрачном веществе. Такие среды являются мутными: дым (твердые частицы в газе), туман (капельки жидкости в газе), взвеси, эмульсии и т. п. Рассеяние в мутных средах называют явлением Тиндаля; 2) оптические неоднородности, возникающие в чистом веществе из-за статистического отклонения молекул от равномерного распределения (флуктуации плотности). Рассеяние света на неоднородностях этого типа называют молекулярным, например рассеяние света в атмосфере. Уменьшение интенсивности света вследствие рассеяния, как и при поглощении, описывают показательной функцией I = I0е –ml (24.10) где m — показатель рассеяния (натуральный). При совместном действии поглощения и рассеяния света ослабление интенсивности также является показательной функцией I = I0е –ml (24.11) где m — показатель ослабления (натуральный). Как нетрудно видеть, m = m + kl Рэлей установил, что при рассеянии в мутной среде на неоднородностях, приблизительно меньших 0,2l, (l. — длина волны света), а также при молекулярном рассеянии интенсивность рассеянного света обратно пропорциональна четвертой степени длины волны (закон Рэлея): I ~ 1/l4 (24.12) Это означает, что из белого света веществом, например в точке Д Меньшее рассеяние красных лучей используют в сигнализации: опознавательные огни на аэродромах, наиболее ответственный свет светофора — красный, и т. п. Инфракрасные лучи рассеиваются еще меньше. На рис. 24.4 изображены две фотографии пейзажа: на левой, снятой обычным методом, туман сильно ограничил видимость; на правой, снятой в инфракрасном излучении на специальной пластинке, туман не мешает, он оказался прозрачным для более длинных волн.
Если взвешенные частицы велики по сравнению с длиной волны, то рассеяние не соответствует закону Рэлея (24.12) — в знаменателе дроби будет стоять l2. Рассеянный свет теряет свою голубизну и становится белее. Так, пыльное небо городов кажется нам белесым в противоположность темно-синему небу чистых морских просторов. Направление рассеянного света, степень его поляризации, спектральный состав и т. д. приносят информацию о параметрах, характеризующих межмолекулярное взаимодействие, размерах макромолекул в растворах, частиц в коллоидных растворах, эмульсиях, аэрозолях и т. д. Методы измерения рассеянного света с целью получения такого рода сведений называют нефелометрией, а соответствующие приборы — нефелометрами. Еще один тип рассеяния света, названный комбинационным рассеянием, был открыт в 1928 г. Г. С. Ландсбергом и Л. И. Мандельштамом в Москве и одновременно Ч. В. Раманом в Индии. Это явление заключается в том, что в спектре рассеяния помимо несмещенной линии, соответствующей частоте падающего света, появляются новые линии, частоты которых n¢ представляют собой комбинацию частоты падающего света n0 и частот ni. (i = 1, 2, ...) колебательных или вращательных переходов рассеивающих молекул: n¢ = n0 ± ni. (24.13) Комбинационное рассеяние можно рассматривать как неупругое соударение квантов с молекулами. При соударении квант может отдать молекуле или получить от нее только такие количества энергии, которые равны разностям двух ее энергетических уровней. Если при столкновении с квантом молекула переходит из состояния с энергией Е' в состояние с энергией Е" (Е" > Е'), то энергия фотона после рассеяния станет равной hn0 - DЕ, где DЕ = Е" - Е'. Соответственно частота кванта уменьшится на n1 = DE/h — возникает спутник с большей длиной волны, который условно называют «красным». Если первоначально молекула находилась в состоянии с энергией Е", она может перейти в результате соударения с фотоном в состояние с энергией Е', отдав избыток энергии DЕ = Е" - Е' кванту. В результате энергия кванта станет равной hn0 + DЕ и частота увеличится на n1 — возникает спутник с меньшей длиной волны, называемый «синим». Рассеяние кванта hn0может сопровождаться переходами молекулы между различными вращательными или колебательными уровнями Е', Е", Е'" и т. д. В результате возникает ряд симметрично расположенных спутников. С помощью метода комбинационного рассеяния определяются собственные частоты колебаний молекулы; он позволяет также судить о характере симметрии молекулы. Спектры комбинационного рассеяния настолько характерны для молекул, что с их помощью осуществляется анализ сложных молекулярных смесей. Спектроскопия комбинационного рассеяния дает информацию, аналогичную получаемой инфракрасной спектроскопией, но имеет то преимущество, что позволяет работать с водными растворами молекул, используя видимый свет, для которого растворитель прозрачен. Направление рассеянного света, степень его поляризации, спектральный состав и другое приносят информацию о параметрах, характеризующих межмолекулярное взаимодействие, размерах макромолекул в растворах, частиц в коллоидных растворах, эмульсиях, аэрозолях, форме частиц и так далее. Методы измерения рассеянного света с целью получения такого рода сведений называют нефелометрией, а соответствующие приборы - нефелометрами.
1.
|
(8)
(9)
(рис. 24.3), будут преимущественно рассеиваться голубые и фиолетовые лучи (направление А), а красные — проходить в направлении Б падающего света. Аналогичное явление наблюдается и в природе: голубой цвет неба — рассеянный свет, красный цвет заходящего Солнца — изменение спектра белого света из-за значительного рассеяния голубых и фиолетовых лучей в толще атмосферы при наклонном падении (см. пояснение к рис. 22.3).