 ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ
| Тема: Облік загальної кількості мікроорганізмів у молоці і визначення колі - титру молока
Лабораторна робота № 5 Мета: Оволодіння чашковим методом визначення загальної кількості бактерій і методом бродильних проб - визначення бродильного титру й колі-титру; оцінка якості молока по його мікробіологічних показниках; ознайомлення з методом безпосереднього підрахунку мікроорганізмів у мазку й непрямим методом кількісного визначення мікроорганізмів у молоці. Зміст роботи (перше заняття). Ознайомлення з правилами відбору проб молока; готування розведень сирого і пастеризованого молока; посів відповідних розведень у чашки Петрі для визначення загальної кількості мікроорганізмів (чашковим методом) і в пробірки з середовищем Кесслера для визначення бродильного титру й колі-титру; ознайомлення з методом безпосереднього підрахунку мікроорганізмів у зафарбованому препараті (мазку із продукту); ознайомлення з непрямим методом приблизного кількісного визначення мікроорганізмів у молоці. Матеріальне забезпечення. Проби молока - сирого й пастеризованого (одна проба на двох учнів); пробірки зі стерильним фізрозчином по 9 мл з розрахунку кількості досліджуваних проб і розведень сирого та пастеризованого молока; чашки Петрі стерильні (по 6 шт. на кожну пробу) і розплавлений МПА - по 15 мл на чашку; середовище Кесслера - по 6 пробірок на кожну пробу молока; піпетки стерильні на 1 мл з розрахунку кількості проб та їхніх розведень і додатково по 4 піпетки для посівів; зафарбовані мазки для демонстрації методу безпосереднього підрахунку мікроорганізмів. Демонстрація реакції на редуктазу з метиленовим синім або із резазурином (початок і закінчення реакції). Зміст роботи (друге заняття). Підрахунок кількості колоній, що виросли на чашках, і визначення загальної кількості бактерій в 1 мл молока (сирого й пастеризованого); визначення (в %) залишкової мікрофлори пастеризованого молока, приймаючи за 100 % кількість мікроорганізмів у сирому молоці; облік результатів термостатування посівів у середовищі Кесслера й запис у таблиці кількості пробірок кожного розведення, у яких виявлений газ, та кількості пробірок без газу; посів штрихами з кожної пробірки, де виявлений газ, на середовище Ендо (з кожної пробірки на окремий сектор). Матеріальне забезпечення. Лупи, підрахункові камери Вольфгюгеля; середовище Ендо в чашках Петрі (по 2 чашки на одну пробу досліджуваного молока). Зміст роботи (третє заняття). Перегляд колоній, що виросли на середовищі Эндо; приготування та фарбування по методу Грама мазків із трьох найбільш характерних для кишкової палички колоній з кожного сектора, мікроскопування мазків і запис результатів у таблиці; посів з колоній кишкової палички, що виросли на середовищі Ендо (при підтвердженні її за результатами мікроскопування), у пробірки із середовищем Козера для ідентифікації кишкової палички (диференціації від цитратпозитивних видів); облік остаточних результатів дослідження (через 20-24 год після посівів з колоній), складання таблиці, визначення колі-титру пастеризованого молока; оцінка якості молока по колі-титру і загальній кількості мікроорганізмів в 1 мл, для чого результати аналізу порівнюють із нормативними показниками стандарту.
Таблиця 1
Матеріальне забезпечення. Мікроскопи, предметні стекла, фарби, реактиви; середовище Козера по 5-6 пробірок на кожну пробу, таблиця для визначення колі-титру молока відповідно до отриманих результатів дослідження. Методичні вказівки. Роботу з обліку загальної кількості бактерій чашковим методом, і визначенню колі-титру молока студенти виконують самостійно, користуючись методичними вказівками й наведеними нижче методиками, складеними відповідно до ГОСТ 9225-84. Облік кількості мікроорганізмів методом прямого підрахунку демонструє викладач, він дає студентам вихідні цифрові дані й разом з ними робить розрахунок кількості мікробів в 1 мл молока. Всі отримані результати дослідження студенти записують в зошит у формі таблиці (табл. 1). На основі цих результатів визначають загальну кількість бактерій, колі-титр пастеризованого молока, оцінюють його якість, ефективність пастеризації молока; визначають бродильний титр сирого молока. Відбір проб молока, правила їхнього пересилання, зберігання й підготовки до дослідження. Відбір проб молока й молочних продуктів для мікробіологічних досліджень проводиться відповідно до ГОСТ 9225—84 і ГОСТ 13928—84, з реєстрацією номера досліджуваної партії в лабораторному журналі. Молоко й вершки після ретельного перемішування відбирають у кількості близько 50 мл стерильним пробовідбірником або черпаком у стерильний посуд із пробкою. Посуд зі зразком закривають пробкою. Пастеризоване молоко відбирають із секції охолодження пастеризаційної установки, для чого обпалюють кран і наливають молоко із крана в стерильний посуд. Узятий зразок негайно досліджують. Якщо взяті проби необхідно доставити в лабораторію, то їх негайно охолоджують до температури 5—6 °С і при цій температурі перевозять або зберігають, але не більше 4 год. з моменту відбору проби. Перед відправленням зразки пломбують або опечатують і наклеюють етикетку, на якій указують дату та годину відбору проби, найменування і температуру продукту, посаду та підпис особи, що відібрала пробу, номер партії. При значному забрудненні молока мікроорганізмами пробу попередньо розбавляють стерильним фізрозчином: стерильною піпеткою відбирають 1мл або зважують із дотриманням правил асептики 1 г досліджуваного продукту, вносять у пробірку з 9 мл стерильної рідини й добре перемішують. З першої пробірки 1 мл суміші переносять у другу пробірку з 9 мл фізіологічного розчину, із другої - у третю, потім - у четверту і т.д. У такий спосіб одержують розведення 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000 і т.д., які позначають I, ІІ, ІІІ, IV розведення і т.д. (рис. 33); досліджуване нерозведене молоко позначають як розведення 0.
Рис. 1. Схема виготовлення розведень і посів в чашки Петрі Облік загальної кількості мікроорганізмів. Чашковий метод - найбільш простий метод кількісного обліку мікроорганізмів, що застосовується для визначення мікробів, здатних рости на щільних поживних середовищах. Він заснований на обліку колоній на агарі в чашках Петрі. Кожне розведення висівають не менш чим у дві чашки Петрі глибинним або поверхневим способом. При глибинному посіві стерильною піпеткою вносять 1 мл розведеної проби на дно стерильної чашки. Якщо піпетка не дотикалася сторонніх предметів, то її можна використати для посіву цієї ж проби в другу чашку. Для посіву наступного розведення беруть нову стерильну піпетку. У чашки виливають по 15 мл розплавленого та охолодженого до температури 44—45 °С поживного середовища, ретельно перемішують досліджуваний матеріал, після чого чашку залишають у горизонтальному положенні для застигання середовища. При поверхневому посіві розплавлене поживне (середовище МПА) попередньо розливають у чашки Петрі. Після застигання середовища підсушують її поверхню, для чого чашку поміщають у сушильну шафу або термостат (температура 40—50 °С) догори дном, край чашки піднімають і ставлять на ободок кришки, через отвір, що утворюється, випаровується конденсаційна вода (желатинові зрізи не підсушують). Підсушування ведуть доти, поки з поверхні середовища не зникнуть краплі конденсаційної води. Після підсушування на поверхню поживного стерильного середовища піпеткою виливають певні розведення проби в кількості 0,1 мл. Посівний матеріал рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища стерильним шпателем, обережно втираючи рідину в середовище. Для кожного посіву використають окремі стерильну піпетку й стерильний шпатель.
Рис.2.Камера Вольфгюгеля для підрахунку колоній Підрахункова камера Вольфгюгеля складається зі скляної пластинки, яка розділена на 144 квадрата площею 1 см2, причому квадрати, розташовані по діагоналі, розділені на 9 малих квадратів. Чашку кладуть догори дном під скляну пластинку, підраховують кількість колоній в 10 квадратах, визначають середнє число колоній в одному квадраті (1 см2) і обчислюють кількість колоній на всій площі чашки. Так, якщо в 10 квадратах 220 колоній, то в 1 квадраті 22 колонії, а на поверхні всієї чашки ця кількість буде дорівнювати 22, помноженому на площу чашки (πr2). В окремих випадках при великій кількості колоній дно чашки Петрі ділять на 4-6 однакових секторів, підраховують число колоній в 2-3 протилежних секторах, знаходять середнє арифметичне число колоній в одному секторі і множать на загальну кількість секторів всієї чашки. Визначивши одним з описаних способів кількість колоній, що виросли на чашці Петрі (вважають умовно, що кожна колонія виросла з однієї клітини), і знаючи ступінь розведення, внесеного в дану чашку, підраховують кількість мікроорганізмів, що містяться в 1 г або в 1 мл проби: якщо при посіві проби 1:10000 (IV розведення) виросло на чашці 139 колоній, то кількість мікробів в 1 мл (або в 1 г) буде дорівнює 139×10 000=1390000. Безпосередній підрахунок мікробів здійснюють під мікроскопом декількома способами. Деякими з них (підрахунок у камерах) враховують клітини безпосередньо в рідині, а іншими - мікроскопують висушений, фіксований і зафарбований препарат. Підрахунок мікробів у зафарбованому препараті ведуть таким способом. Точно каліброваною піпеткою відміряють 0,01 мл досліджуваної рідини і наносять на поверхню в 1 см2 предметного скла. Мазок висушують, фіксують і красять метиленовою синню або фарбою по Муромцеву. Підраховують кількість мікробів в окремих полях зору. Підбором системи й зміною довжини тубуса діаметр поля зору бажано встановлювати на таку величину, щоб відповідна йому площа поля зору виражалася у квадратних сантиметрах дробом 1/а, де а — можливо просте ціле число (наприклад, 5000, 10 000 і т.п.). При користуванні імерсійними системами й окулярами це легко досягається при двох наступних комбінаціях. Об'єктив 90, окуляр 10, довжина тубуса мінімальна (близько 145 + револьвер); при цьому полі зору можна встановити точно на 0,16 мм за допомогою об'єктмікрометра, причому довжину тубуса змінюють до тих пір, поки на максимальній ширині поля зору не укладуться точно 16 поділок мікрометра (кожна поділка дорівнює 0,01 мм). При цьому площа поля зору дорівнює 0,02 мм2, що становить 1/5000 см2. Так як на всій площі мазка (1 см2) розподілені 0,01 мл, то кількість матеріалу, який знаходиться на поверхні скла, рівної площі одного поля зору, відповідає в середньому 1/500000 мл. Тому, що для одержання остаточного результату (визначення кількості клітин в 1 мл) потрібно середнє число клітин на одному полі зору, знайдене в ряді підрахунків, помножити на 500000. Непрямий метод визначення кількості бактерій у молоці - проба на редуктазу. Суть методу полягає в тому, що в процесі життєдіяльності бактерії виділяють у навколишнє середовище речовини, що мають відновлювальні властивості, у тому числі анаеробні дегідрогенази (редуктази). Редуктазну пробу використають як непрямий показник бактеріального обсіменіння сирого молока та вершків. Для редуктазної проби відбирають середню пробу молока: після органолептичної оцінки і розсортовування по кислотності із середньої проби відбирають зразок об’ємом близько 50 мл. Проба на редуктазу з метиленовим синім (блакитним) полягає в наступному. Для проведення проби на редуктазу в чисті сухі пробірки наливають по 1 мл робочого розчину метиленового синього й по 20 мл досліджуваного молока, закривають, повільно три рази перевертають пробірки, потім поміщають їх у редуктазник (рис. 3) або водяну баню (температура води 38 °С). Вода після занурення пробірок з молоком повинна доходити до рівня молока в них.
Рис. 3. Редуктазник 1 – кришка; 2 – камера для розміщення пробірок; 3 – штатив.
Зміну забарвлення молока фіксують через 20 хв., 1 год., 2 год., 5 год. 30 хв. Закінченням аналізу вважають момент знебарвлення молока. В залежності від тривалості знебарвлення молоко відносять до одного із чотирьох класів (табл. 2).
Таблиця 2
Пробу проводять не рідше 1 разу в декаду. Розчин метиленового синього готують наступним чином. Спочатку готують насичений спиртовий розчин, змішуючи 10 г фарби з 100 мл 96 %- ного етилового спирту. Суміш ставлять у термостат при температурі 37 °С на 24 год., а потім фільтрують. Для приготування робочого розчину метиленового синього змішують 5 мл насиченого спиртового розчину фарби з 195 мл дистильованої води.
Проба на редуктазу з резазурином дозволяє з більшою точністю розмежувати молоко на класи. Резазурин має деякі переваги перед метиленовим синім. Відновлюється він у дві стадії, процес повного відновлення закінчується при більш високому окислювально-відновлювальному потенціалі, чим у метиленового синього. Таблиця 3
Розчин резазурину одержують таким чином: 100 мг речовини розчиняють в 200 мл прокип'яченої і охолодженої дистильованої води. Термін зберігання основного розчину при температурі 8—10 °С не більше 30 діб. Робочий розчин резазурину готують із основного розведенням його прокип'яченою охолодженою дистильованою водою у співвідношенні 1:2,5 (наприклад, до 10 мл основного розчину додають 25 мл води). Термін зберігання робочого розчину 7 діб при температурі не вище 8—10 °С. Зберігають розчини резазурину в пляшках, захищених від світла, або в пляшках із темного скла. Для проведення проби в стерильні пробірки наливають по 1 мл робочого розчину резазурину і по 10 мл досліджуваного молока і закривають стерильними пробками. Рідини змішують повільним трикратним перевертанням пробірок. Пробірки поміщають у редуктазник або водяну баню при температурі 38 °С, яку підтримують протягом всього дослідження. Пробірки з молоком і резазурином в процесі аналізу повинні бути захищені від прямих сонячних променів. Резазурин переходить спочатку в резофурин (реакція необернена), забарвлення поступово змінюється від синьо-сталевого через всі відтінки лілового кольору до рожевого при окислювально-відновлювальному потенціалі 0,2-0,05 В. Потім резофурин відновлюється в безбарвний дігідрорезофурин при потенціалі 0,15-0 В (ця реакція обернена). Покази знімають через 20 хв. і через 1 год, не струшуючи й не перевертаючи пробірок. Після оцінки результатів через 20 хв. пробірки із знебарвленим молоком видаляють із редуктазника. Поява забарвлення молока в цих пробірках при струшуванні не враховується. Пробірки, що залишилися, однократно перевертають і витримують у редуктазнику до кінця аналізу. В залежності від тривалості знебарвлення молока його відносять до одного із чотирьох класів (табл. 3).
Визначення титру кишкової палички (колі-титру) молока. Колі-титр — це найменша кількість продукту, виражена в грамах або міллілітрах, в якій виявлені цитратнегативні різновидності бактерій групи кишкових паличок (після ідентифікації). У сирому молоці та вершках визначають тільки бродильний титр. Бродильний титр - це найменша кількість продукту, виражена в міллілітрах або грамах, у якій виявлені бактерії групи кишкових паличок, тобто грамнегативні палички, що розкладають глюкозу на кислоту і газ при температурі 43 °С протягом 24 год. Посів у середовище Кесслера (перша бродильна проба) проводять відповідно до даних, наведених в табл. 1.
Таблиця 4
Оцінку результатів першої бродильної проби ведуть таким чином. Після термостатування при температурі 43 °С протягом 18—24 год пробірки з посівами на середовище Кесслера переглядають і встановлюють бродильний титр молока (вершків), приймаючи (умовно) утворення газу і його скупчення в бродильних пробірках (поплавках) як показник присутності в даних пробірках бактерій групи кишкових паличок. При відсутності газу у всіх пробірках продукт вважають не забрудненим кишковими паличками. Бродильний титр розраховують за даними табл. 4. Таким чином, якщо кишкова паличка виявлена в декількох засіяних об’ємах, то за колі-титр приймають найменшу кількість продукту, у посіві якого виявлена кишкова паличка; якщо в жодному із засіяних об’ємів не виявлена кишкова паличка, колі-титр вважається більшим суми засіяних об’ємів, а якщо кишкова паличка виявлена у всіх засіяних об’ємах продукту, то колі-титр вважається меншим найменшого засіяного об’єму продукту. Таким же правилом керуються при визначенні бродильного титру продукту. При дослідженні пастеризованих молока, вершків та інших продуктів, нормованих по вмісту палички, потрібно виділяти та ідентифікувати чисті культури кишкових паличок із пробірок з середовищем Кесслера, у яких виявлене газоутворення, якщо продукт має бродильний титр нижче 0,3 або 0,1 (для сухого молока). Для виділення чистих культур роблять посів на середовище Ендо із пробірок, що забродили (з середовищем Кесслера). Чашки з підсушеним середовищем Ендо ділять по дну олівцем на 4 сектори. З кожної пробірки беруть стерильною бактеріологічною петлею мінімальну кількість посівного матеріалу і висівають його на окремі сектори частими штрихами з таким розрахунком, щоб виросли ізольовані одна від одної колонії. Чашки з посівами поміщають (кришками вниз) у термостат і витримують при температурі 37 °С протягом 18—24 год. Середовище Ендо повинно бути свіжоприготовленим. На середовищі Ендо бактерії групи кишкових паличок утворюють колонії від темно-червоного до рожевого кольору, а патогенні бактерії (збудники кишкових інфекцій) утворюють безбарвні колонії. Щоб уникнути почервоніння самого середовища його захищають від світла. Утворення червоних колоній обумовлюється бродінням лактози: чим енергійніше зброджується лактоза, тим інтенсивніше забарвлюються колонії в червоний колір. Облік результатів росту на середовищі Эндо ведуть таким чином. При відсутності на середовищі Ендо колоній, характерних для бактерій групи кишкових паличок (червоних, іноді з металевим блиском, рожевих, блідо-рожевих), продукт вважають незабрудненим кишковими паличками. При наявності на середовищі Ендо червоних колоній з різними відтінками, а також безбарвних колоній їх вивчають, для чого з ізольованих колоній кожного сектора роблять мазки, зафарбовують їх по Граму і мікроскопують. Бактерії групи кишкових паличок - короткі, безспорові грамнегативні палички (зафарбовані в червоний колір). При систематичному виявленні безбарвних колоній грамнегативних паличок у посівах на середовище Ендо щоб уникнути поширення патогенних бактерій кишкової групи (якщо лабораторія розташована на території підприємства), чашки з безбарвними колоніями передають у лабораторії санітарно-епідеміологічних станцій для подальшого вивчення. Ідентифікація БГКП полягає в наступному. Із всіх варіантів, характерних для кишкових паличок колоній (по одній колонії з кожного сектора середовища Ендо), у мазках з яких виявлені грамнегативні палички, роблять посів петлею на цитратне середовище Козера з метою ідентифікації кишкових паличок і диференціації Е. coli від бактерій родів Citrobacter та Enterobacter. Пробірки з посівами в середовище Козера витримують у термостаті при температурі 37 °С протягом 18—24 год, після чого оцінюють результат. Облік і оцінку результатів ведуть наступним чином. Відсутність росту на середовищі Козера (колір середовища не змінюється) вказує на те, що бактерії, посіяні з даної колонії, відносяться до цитратнегативних бактерій групи кишкових паличок (Е. coli), які враховують при визначенні колі-титру. Зміна оливково-зеленого кольору середовища Козера на волошковий свідчить про те, що посіяні з даної колонії бактерії відносяться до цитратпозитивних видів кишкових паличок, які при визначенні колі-титру не враховують. У результаті проведеної ідентифікації вважають позитивними на присутність кишкової палички (Е. coli) всі ті об’єми молока (вершків), в посівах із яких виявлені грамнегативні неспороутворюючі палички, які викликають бродіння глюкози в середовищі Кесслера з утворенням кислоти і газу при 43 °С, але не ростуть на середовищі Козера, тобто не змінюють кольору індикатора в складі цього середовища; не враховують різновиди кишкових паличок, які дають ріст на цитратному середовищі Козера. На основі цього обчислюють колі-титр досліджуваного пастеризованого молока (або вершків) (див. табл. 4).
Контрольні питання 1. У чому полягають правила відбору проб молока для проведення досліджень? 2. Яка методика приготування розведень молока для мікробіологічного дослідження? 3. Які розведення сирого і пастеризованого молока готують та на які середовища їх висівають для визначення загальної кількості мікроорганізмів і колі-титру молока? 4. Вкажіть температуру та тривалість термостатування посівів для обліку загальної кількості мікроорганізмів і для визначення колі-титру? 5. Як визначають загальну кількість мікроорганізмів чашковим методом? 6. У чому полягають принцип і порядок обліку загальної кількості мікроорганізмів прямим підрахунком клітин у зафарбованих мазках? 7. Яка суть і методика проведення реакції на редуктазу з метиленовим синім і з резазурином? 8. Для чого роблять посіви на середовище Ендо при визначенні колі-титру? Які колонії на цьому середовищі вважають характерними для кишкових паличок? 9. Які морфологічні ознаки бактерій в мазках, приготовлених з колоній, вважають характерними для кишкових паличок? 10. Для чого роблять посів на середовище Козера, як термостатують посіви і оцінюють результати росту на цьому середовищі? 11. Який принцип визначення колі-титру молока? Як оцінюють якість молока по колі-титру і загальній кількості мікроорганізмів в 1 мл?
|
Після посіву чашки поміщають у термостат догори дном і витримують при температурі 21—22 ° С (желатинові середовища) або 35—37 °С (агарові середовища). Через 48 год., користуючись лупою, підраховують колонії, для чого вибирають ті чашки, у яких колонії ізольовані одна від одної і їх кількість не менш 20 і не більше 300. Якщо кількість колоній велика й прямий підрахунок їх неможливий, то застосовують підрахункові камери Вольфгюгеля (рис. 2) або інші.